Оценка активности национального стандарта туберкулина для млекопитающих относительно первого международного стандарта туберкулина bovine
Али Найманов
Козлов В.Е., Безгин В.М., Шумилов К.В., Букова Н.К., Найманов А.Х., Мясоедов Ю.М., Ничвеева Л.Д., Абрамов В.Н., Дубинин В.С.
ФГУП «Курская биофабрика», ФГУ ВГНКИ, ВИЭВ, Департамент ветеринарии, Управление ветеринарии Волгоградской области
В ряду методов, используемых при выявлении животных, больных туберкулезом, в качестве основного теста, нормативные документы МЭБ и ЕЭС предусматривают тест на развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) при внутрикожном введении туберкулина. Для определения сенсибилизации животных атипичными микобактериями также используется сравнительная внутрикожная туберкулиновая проба с одновременным введением равных доз туберкулинов для птиц и для млекопитающих.
Благодаря более высокой специфичности, а также возможности стандартизации очищенных препаратов в последние десятилетия очищенный ППД-туберкулин практически полностью вытеснил из ветеринарной практики альт-туберкулин и HCST-туберкулин. Определяющими характеристиками для туберкулиновых препаратов являются активность и специфичность. Активность туберкулинов определяется сравнением испытуемых образцов с соответствующим международным стандартом или с эталонной серией (национальным стандартом), откалиброванной относительно международного стандарта.
Необходимым условием использования того или иного стандарта является соответствие его биохимических характеристик с контролируемым препаратом. В связи с чем международными лабораториями в разное время было разработано несколько вариантов международных стандартов для контроля различных туберкулинов.
Первый международный стандарт был предложен для контроля альт-туберкулина, в 1928 году этот стандарт был утвержден комитетом Лиги наций. В 1951 году был утвержден международный стандарт очищенного сухого туберкулина для млекопитающих (стандарт лаборатории Зейберт). Страны ЕС в 60-70-е годы приняли ряд дополнительных стандартов для контроля HCST-туберкулина и туберкулина очищенного ППД для КРС.
Первый международный стандарт для контроля туберкулина очищенного ППД для крупного рогатого скота официально был представлен ВОЗ в 1986 году. С 90-х годов прошлого века производители очищенных ППД-туберкулинов для КРС перешли на утвержденный ВОЗ Первый международный стандарт PPD bovine, в связи с чем возникли определенные сложности в выражении действующих единиц активности туберкулина в странах, где данный стандарт еще не внедрен.
Требования Всемирной торговой организации и разработанный на их основе закон РФ «О техническом регулировании» предполагают однозначное соответствие продукции (тем более диагностических препаратов) утвержденным международным стандартам.
Целью работы было проведение комиссионных испытаний эталонной серии туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих по отношению к Первому международному стандарту туберкулина PPD bovine. В комиссии (приказом Департамента ветеринарии МСХ РФ № 33 от 11.12.2002 г.) участвовали сотрудники Департамента ветеринарии МСХ РФ, профильных лабораторий ВГНКИ, ВИЭВ, Курской биофабрики и Управления ветеринарии Волгоградской области.
Материалы и методы
На основании методов, предусмотренных OIE Manual of Standards for Diagnostic Test and Vaccines (2), материалов Комитета экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов (1) и наставлению NIBSC по применению Первого международного стандарта, проводили определение биологической активности серии № 3А, изготовленной на Курской биофабрике 12.02.02 г., по отношению к Первому международному стандарту туберкулина (PPD) bovine, полученному в январе 2002 г. из Национального института биологических стандартов и контроля (NIBSC, Вейбридж, Великобритания). Серия № 3А была предварительно комиссионно проконтролирована на морских свинках и на больном туберкулезом КРС и является эталонной серией для определения биологической активности производственных серий туберкулина (ППД) для млекопитающих. В одном флаконе серии № 3А содержится 1000000 ТЕ (туберкулиновых единиц активности). Опыты на морских свинках проводили на базе Курской биофабрики. Сравнение образцов национального и международного стандартов туберкулинов на поголовье КРС, больного туберкулезом, проводили в тубизоляторе СПК «Верхне-Черенский» Волгоградской области. Целью проведения калибровки являлось определение количества анализируемого препарата, которое обладало специфическим биологическим эффектом, эквивалентным указанному количеству в международном стандарте при определенном сочетании условий испытания.
Такими условиями являются:
— сенсибилизация морских свинок за 4-6 недель до опытов вакциной БЦЖ или штаммом М. bovis, из которого изготовлен международный стандарт (в нашем случае это штамм АN5);
— установленные для различных вариантов сенсибилизации дозы введения сравниваемых туберкулинов;
— равная интенсивность (± 20 %) реакций ГЗТ, развивающихся на введение туберкулинов;
— параллельность графиков зависимости интенсивности реакции от логарифма дозы для сравниваемых образцов;
— высокие требования к доверительным границам эксперимента (64 – 156 % при р = 0,95).
Для проведения стандартизации активности национального стандарта (серии № 3А) на больном туберкулезом КРС применяли предусмотренные наставлением для Международного стандарта дозы введения 3250 МЕ и 650 МЕ для каждого из образцов туберкулинов. Национальный стандарт разводили из расчета содержания единиц активности 220000 МЕ во флаконе. Животным делали 4 внутрикожные инъекции – по две с каждой стороны шеи, используя при этом латинский квадрат.
Результаты исследований
Предварительно был поставлен эксперимент по титрации национального стандарта (серии № 3А). Результаты предварительного эксперимента, проведенного на морских свинках, представлены на рисунке 1.
Прямые зависимости логарифм дозы – диаметр реакции для международного стандарта и образца национального стандарта (серия № 3А) – параллельны, но R – относительная активность серии № 3А – составила 0,23. Эксперимент необходимо было повторить с учетом полученных данных.
Такие результаты были ожидаемы. Принятая документами МЭБ и ЕС доза введения туберкулина КРС составляет 2000 МЕ Первого международного стандарта (PPD) bovine, а доза, применяемая в России, составляет 10000 туберкулиновых единиц активности. На графике проэкстраполировано выражение величины дозы введения в единицах активности, отличающихся от значений, принятых в нашей стране, в 5 раз. Как видно, в этом случае прямые зависимости доза – эффект для серии № 3А и Международного стандарта идентичны. С учетом полученных данных при проведении комиссионных испытаний мы исходили из предположения, что во флаконе национального стандарта туберкулина (ППД) для млекопитающих серии № 3А содержится 240000 МЕ активности Первого международного стандарта (PPD) bovine, то есть, в 4 – 5 раз ниже принятого у нас значения – 1000000 единиц. В таблице 1 представлены результаты экспериментов, проведенных на трех группах морских свинок. Как видно из данных таблицы, интенсивность реакции на сопоставимые дозы Первого международного стандарта и серии № 3А практически равны. Средняя величина относительной активности Rср. составила 0,927, таким образом, уточненное содержание единиц активности Первого международного стандарта (PPD) bovine в одном флаконе национального стандарта составило 240000 МЕ х 0,927 = 220000 МЕ. На рисунке 1 представлены прямые титрации образцов.
Результаты испытания активности национального стандарта туберкулина ППД для млекопитающих на больном туберкулезом КРС представлены в таблице 2. Анализ результатов таблицы 2 позволяет сделать вывод об отсутствии разницы в выявлении больных туберкулезом животных при использовании равнозначных доз Первого международного стандарта (PPD) bovine и национального стандарта туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих. При сравнении интенсивности кожных реакций у КРС не выявлено достоверных различий средних величин ответных реакций на каждую из сравниваемых доз введения национального и международного стандартов. Таким образом, подтверждены результаты, полученные в испытаниях на морских свинках.
На рисунке 2 представлены сводные результаты экспериментов, проведенных на морских свинках и на поголовье КРС.
Выводы
1. Активность национального стандарта туберкулина ППД для млекопитающих, установленная относительно Первого международного стандарта (PPD) bovine, составляет 220000 МЕ во флаконе, что эквивалентно значению активности 1000000 единиц в одном флаконе.
2. Производственные серии туберкулина (ППД) для млекопитающих в стандартном разведении, активность которых установлена по национальному стандарту, содержат в среднем 200000 МЕ во флаконе и имеют удельную активность 10000 МЕ/мл, что эквивалентно используемому в настоящее время значению удельной активности 50000 ТЕ/мл.
3. Таким образом, при введении 0,2 мл стандартного раствора туберкулина (ППД) для млекопитающих КРС доза введения составит 2000 МЕ Первого международного стандарта (PPD) bovine или 10000 единиц.
Таблица 1
Результаты определения активности национального стандарта
туберкулина (ППД) – серии № 3А относительно Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine на морских свинках
|
№№опыта |
Наименование Препарата |
Среднее значение диаметра эритемы, мм |
Относи тель-ная актив-ность, R |
n
животных |
Доверитель-ный интер-вал при Р=0,95, % |
|||
|
Доза введения, МЕ |
||||||||
|
20 |
10 |
5 |
2,5
|
|||||
|
1 |
ППД № 3А |
21,75 |
18,00 |
15,67 |
13,17 |
0,88 |
9 |
81 – 122 |
|
Международный стандарт |
22,33 |
18,33 |
16,92 |
13,25 |
||||
|
2 |
ППД № 3А |
21,56 |
18,17 |
14,39 |
10,78 |
1,02 |
9
|
82 – 121 |
|
Международный стандарт |
20,39 |
17,61 |
14,06 |
12,56 |
||||
|
3 |
ППД № 3А |
22,55 |
16,25 |
13,15 |
9,55 |
0,89 |
10 |
82 – 120 |
|
Международный стандарт |
19,70 |
17,20 |
15,05 |
11,85 |
||||
R ср = 0,927
В одном флаконе содержится: 0,927 х 240000 = 220000 МЕ Первого международного стандарта туберкулина (PPD) bovine.
Таблица 2
Результаты испытания активности национального стандарта
туберкулина (ППД) для млекопитающих, серии 3А по отношению к Первому международному стандарту туберкулина (PPD) bovine на больном туберкулезом крупном рогатом скоте
|
№№ живот-ного |
Толщина кожной складки до инъекции, мм |
Увеличение кожной складки через 72 часа после инъекции туберкулинов, мм |
|||
|
Национальный стандарт, сер. № 3А Доза инъекции |
Международный стандарт PPD bovine Доза инъекции |
||||
|
3250 МЕ |
650 МЕ |
3250 МЕ |
650 МЕ |
||
|
2 |
5 |
2 |
2 |
4 |
3 |
|
3 |
7 |
3 |
5 |
7 |
4 |
|
4 |
5 |
7 |
6 |
8 |
7 |
|
5 |
6 |
3 |
0 |
9 |
5 |
|
6 |
6 |
10 |
7 |
10 |
11 |
|
7 |
6 |
7 |
3 |
3 |
4 |
|
8 |
6 |
4 |
3 |
3 |
1 |
|
9 |
8 |
14 |
5 |
10 |
5 |
|
10 |
6 |
5 |
6 |
6 |
4 |
|
11 |
8 |
5 |
0 |
8 |
3 |
|
12 |
6 |
5 |
8 |
9 |
11 |
|
13 |
6 |
11 |
7 |
12 |
6 |
|
14 |
7 |
6 |
0 |
7 |
5 |
|
17 |
7 |
7 |
4 |
7 |
6 |
|
18 |
5 |
8 |
9 |
10 |
11 |
|
19 |
5 |
3 |
2 |
0 |
0 |
|
21 |
8 |
11 |
8 |
13 |
7 |
|
22 |
8 |
4 |
4 |
6 |
8 |
|
23 |
7 |
8 |
3 |
8 |
9 |
|
24 |
5 |
7 |
7 |
5 |
5 |
|
25 |
7 |
11 |
7 |
12 |
10 |
|
26 |
6 |
7 |
5 |
6 |
6 |
|
27 |
7 |
3 |
1 |
5 |
1 |
|
28 |
7 |
5 |
6 |
5 |
7 |
|
Количество реагирующих животных |
24 |
20 |
23 |
21 |
|
Список литературы
1. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. – Женева. – 1988. – 36 доклад. – С. 29-49.
2. OIE Manual of Standards for Diagnostic Test and Vaccines. – 2000. – P. 359-369.
