ПЦР при диагностике паратуберкулеза крупного рогатого скота
Али Найманов
А.Х. Найманов, доктор ветеринарных наук,
В.М. Калмыков, аспирант
ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» (Москва)
Введение
Паратуберкулез (паратуберкулезный энтерит, болезнь Jonne) ― хроническая инфекционная болезнь животных, характеризующаяся поражением кишечника и мезентериальных лимфатических узлов, сопровождающаяся расстройством ЖКТ, прогрессирующим истощением до летального исхода.
Болезнь чаще регистрируют у жвачных животных. Из домашних жвачных, главным образом, у КРС молочного направления, овец, коз и верблюдов. Выделение возбудителя из организма зараженных особей происходит, в основном, с фекалиями, реже с мочой и молоком.
Возбудителя болезни впервые выделили Н.А. Johne и L. Frothingham в 1895 году из подвздошной кишки коровы, больной паратуберкулезом. В 1912 году T.W. Twort, G.Z Ingram изолировали возбудителя паратуберкулеза и назвали его Mycobacterium enteritidis chronicae bovis. В дальнейшем возбудитель болезни квалифицирован как Mycobacterium paratuberculosis, а затем как Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (МАР). МАР на 99 % генетически родственны с Mycobacterium avium, но отличаются микобактин-зависимостью, то есть, растут на питательных средах, содержащих фактор роста (микобактин). В последние годы возбудитель паратуберкулеза отнесен к комплексу Mycobacterium avium – intracellulare.
Паратуберкулез КРС широко распространен в мире. По данным МЭБ, в начале XXI века заболевание регистрировали в 60 странах мира [1]. На начало 2012 года в Российской Федерации зарегистрировано 4 неблагополучных пункта по паратуберкулезу КРС: в Брянской области (1), Сахалинской (2), Удмуртской республике (1). Экономический ущерб от болезни обусловлен значительным снижением продуктивности животных: потерей молочной продуктивности, истощением, бесплодием и, как следствие, выбраковкой больного поголовья.
Паратуберкулез был и остается одной из сложно контролируемых и диагностируемых инфекций, так как инкубационный период длится от шести месяцев до 15 лет. При этом носители микобактерий могут не иметь клинических признаков болезни, но, периодически выделяя возбудителя во внешнюю среду, заражать восприимчивых животных. Некоторые авторы проблему паратуберкулеза сравнивают с верхушкой айсберга ― так называемый «айсберг–эффект», когда на один клинический случай приходится 15–20 инфицированных животных, у которых болезнь протекает в латентной форме. «Скрытость» инфекции, низкие специфичность и чувствительность методов диагностики, сложность выделения и культивирования микобактерий паратуберкулеза, а также отсутствие возможности воспроизведения болезни на лабораторных животных ― вот основные причины, затрудняющие постановку диагноза этого давно известного, но недостаточно изученного хронического заболевания.
Достижения в области молекулярной генетики привели к разработке новых подходов к обнаружению возбудителя в диагностическом материале. На протяжении последних лет широко используют молекулярные технологии для генотипирования и дифференциации возбудителей на уровне ДНК, в частности, ПЦР.
В зарубежной литературе имеются сообщения об успешном испытании ПЦР при диагностике паратуберкулеза КРС [2]. Чувствительность и специфичность ПЦР определяли исследованием фекалий и сывороток крови молочных коров штата Индиана (США). Результаты ПЦР сравнивали с результатами культурального метода на жидких и твердых питательных средах и ИФА. Авторы оценили ПЦР как более точный и экспрессивный метод идентификации МАР, рекомендуют его применять при установлении статуса стад в отношении паратуберкулеза и включить в программу борьбы с этой инфекцией.
В доступной отечественной литературе сведений о применении ПЦР при диагностике паратуберкулеза КРС мы не обнаружили. Поэтому, учитывая недостаточную изученность некоторых важных вопросов диагностики, длительность, трудоемкость и сравнительно низкую эффективность классических методов прижизненной и лабораторной диагностики, изучение возможности применения метода ПЦР при диагностике паратуберкулеза КРС является вполне своевременным и актуальным.
Цель исследования
Определить возможность применения ПЦР при диагностике паратуберкулеза КРС.
Материалы и методы
Исследования по диагностике паратуберкулеза КРС проводили в соответствии с «Наставлением по диагностике паратуберкулеза (паратуберкулезного энтерита) животных», утвержденного Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 05.01.2001 г., № 13-5-02/0050.
Для ПЦР–исследования проб фекалий от коров использовали тест-системы «ПАРАТУБ» и «АВИУМ».
Результаты
Базой для исследования послужило хозяйство, где были выявлены животные, подозреваемые в заражении паратуберкулезом. В 2010 году были выявлены коровы с длительной диареей и, как следствием этого, незначительным истощением и потерей молочной продуктивности.
В соответствии с представленными актами диагностических исследований, проведенных местной ветеринарной службой, и экспертизами лабораторных исследований, в декабре 2010 года межрайонной ветеринарной лабораторией при бактериологическом исследовании проб фекалий от пяти первотелок в двух пробах обнаружен возбудитель паратуберкулеза. В целях уточнения диагноза проведен комиссионный диагностический убой двух коров, у которых результаты бактериоскопии указали на паратуберкулез. При патолого-анатомическом исследовании не обнаружено изменений, характерных для паратуберкулеза. От убитых коров выделена культура возбудителя паратуберкулеза.
В марте 2011 года проведен комиссионный осмотр 404 голов КРС. Животных с клиническими признаками паратуберкулеза не обнаружено. В апреле исследовано 408 проб сыворотки крови коров методом РСК. Выявлено пять животных с положительным и одну особь с сомнительным результатом РСК. В апреле 2011 года все шесть животных были исследованы аллергической внутрикожной пробой с использованием ППД-туберкулина для птиц. Реагирующих не выявлено. В тот же период сыворотка крови от этих животных повторно была исследована в РСК. При повторном исследовании было получено только три положительных результата.
По результатам исследований проведен диагностический убой одной коровы с положительными результатами РСК. При патолого-анатомическом исследовании не обнаружено изменений, характерных для паратуберкулеза. При бактериологическом исследовании патматериала от убитой коровы возбудитель паратуберкулеза не выделен. Однако при бактериоскопическом исследовании патматериала обнаружены кислото- спиртоустойчивые палочки, расположенные полисадом, кучками и давшие основание предполагать наличие возбудителя паратуберкулеза.
В мае 2011 года проведен комиссионный клинический осмотр всего поголовья КРС хозяйства. Животных с клиническими признаками паратуберкулеза не обнаружено.
В связи с сомнениями и сложностью установления диагноза на паратуберкулез, дальнейшие исследования проводили комиссионно, совместно с сотрудниками лаборатории микобактериозов ВИЭВ.
В августе 2011 года в комплексе, где выявлялись подозреваемые в заражении паратуберкулезом животные, проведены комиссионный клинический осмотр поголовья и учет аллергических реакций на внутрикожное введение ППД-туберкулина для птиц. Животных с клиническими признаками паратуберкулеза не выявлено. При учете аллергических реакций через 72 часа после введения туберкулина для птиц реагирующих также не выявлено.
От животных этого комплекса были отобраны 32 пробы фекалий для ПЦР-исследования в ВИЭВ на наличие возбудителя паратуберкулеза. При исследовании ДНК МАР и ДНК M. avium не выделено.
Кроме того, при посещении диагностического центра и беседе с сотрудниками установлено, что при бактериологическом исследовании патматериала от убитых (подозреваемых в заражении паратуберкулезом) животных посевы проводили на обычные питательные среды, используемые для диагностики туберкулеза, без добавления фактора роста (экстракта из M. phlei). В связи с тем, что возбудитель паратуберкулеза в первых генерациях растет и размножается на питательных средах только в присутствии фактора роста, для идентификации выделенных культур микобактерий необходимо было эти культуры посеять на питательные среды с фактором роста и без него. К сожалению, это важное условие идентификации культур микобактерий и диагностики паратуберкулеза не было выполнено. Поэтому выделенные культуры нетуберкулезных (атипичных) микобактерий были ошибочно охарактеризованы как M. paratuberculosis.
Следует указать, что в соответствии с «Наставлением по диагностике паратуберкулеза (паратуберкулезного энтерита) животных» от 2001 года, диагноз на паратуберкулез считается установленным при наличии у животного характерных клинических признаков болезни и получения одновременно положительного результата бактериоскопического или гистологического исследования биоматериала от этих животных; при обнаружении характерных патолого-анатомических изменений в кишечнике и мезентериальных лимфатических узлах животных с гистологическим или бактериоскопическим подтверждением болезни, независимо от наличия или отсутствия клинических признаков заболевания.
Анализ всей ранее проведенной диагностической работы, а также комиссионных диагностических исследований показывает отсутствие в стаде животных с характерными клиническими признаками паратуберкулеза, а также характерных патолого-анатомических изменений в кишечнике и мезентериальных лимфатических узлах с гистологическим или бактериоскопическим подтверждением. Кроме того, ранее выделенные кислото-спиртоустойчивые микобактерии и культуры микобактерий не идентифицированы как M. paratuberculosis, а из фекалий подозреваемых в заболевании паратуберкулезом животных ПЦР-исследованием не выделено ДНК МАР и ДНК M. avium.
Выводы
В связи со сложностью диагностики паратуберкулеза, диагностические исследования необходимо проводить в соответствии с «Наставлением по диагностике паратуберкулеза» в комплексе с современными дополнительными методами исследований. Обнаружение в патматериале или фекалиях кислото-спиртоустойчивых палочек указывает на наличие микобактерий, но не является основанием для установления диагноза на паратуберкулез. При бактериологическом исследовании патматериала на это заболевание необходимо использовать специальные питательные среды с добавлением фактора роста (микобактин). В комплексе диагностических исследований ПЦР-анализ фекалий коров, подозреваемых в заражении паратуберкулезом, представляет собой эффективный дополнительный тест для подтверждения или исключения заражения животных M. paratuberculosis.
Практическое предложение
В комплекс методов диагностики паратуберкулеза КРС необходимо включить ПЦР-анализ фекалий животных, подозреваемых в заражении паратуберкулезом, для выявления ДНК МАР.
Библиография
1. Шуляк Б.Ф. 110 лет со дня открытия возбудителя паратуберкулёза // Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные, 2005; 9: 238―239.
2. Alinovi C.A., Ward M.P., Lin Tsang Long, Moore G.E., Wu Ching Ching. Real-time PCR, compared to liquid and solid culture media and ELISA, for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis // Veterinary Microbiology, 2009; 136 (1/2): 177―179.
