ПЦР-исследование аллергенов, используемых в широкой ветеринарной практике при диагностике туберкулёза животных
Али Найманов
Аспирант лаборатории микобактериозов ВИЭВ В.М.Калмыков
Научный руководитель, заведующий лабораторией микобактериозов ВИЭВ, профессор, д.в.н. А.Х.Найманов
Доцент кафедры ветеринарной вирусологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ, к.в.н. М.С.Калмыкова
Научный сотрудник ЦНИИЭ Е.А.Долгова
Научный сотрудник ЦНИИЭ М.В.Альварес Фигероа
г. Москва
Введение
В настоящее время мероприятия по профилактике и борьбе с туберкулёзом животных в России проводят в соответствии с санитарными и ветеринарными правилами «Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных», утверждёнными Госкомсанэпиднадзором и Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 18 июня 1996 года и «Наставлениями по диагностике туберкулёза животных», утверждёнными Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 18 ноября 2002 года.
В соответствии с этими утверждённых нормативными документами, основным методом прижизненной диагностики туберкулёза крупного рогатого скота является внутрикожная проба с ППД-туберкулином для млекопитающих. В качестве дополнительных методов диагностики применяют глазную пробу, пальпебральную пробу, внутривенную пробу, симультанную пробу с ППД-туберкулином для млекопитающих и комплексным аллергеном из атипичных микобактерий (КАМ), а также симультанную пробу с ППД-туберкулином для млекопитающих и ППД-туберкулином для птиц.
Симультанную пробу с ППД-туберкулином для млекопитающих и ППД-туберкулином для птиц применяют для дифференциации неспецифических реакций у крупного рогатого скота и свиней при первичной постановке диагноза. Кроме этого, для контроля за благополучием животных по туберкулёзу в стадах, где реакции на туберкулин обусловлены сенсибилизацией животных микобактериями комплекса авиум-интрацеллюляре или атипичными микобактериями.
Симультанную пробу с ППД-туберкулином для млекопитающих и КАМ применяют для диагностики туберкулёза крупного рогатого скота при первичной постановке диагноза, а также для контроля за благополучием хозяйств, где реакции на туберкулин обусловлены сенсибилизацией животных атипичными микобактериями.
В последние годы в доступной литературе появились работы некоторых исследователей (А.П. Лысенко с соавт., 1998; В.В. Власенко с соавт., 2003), указывающие, что в процессе изготовления туберкулина не происходит глубокой биологической очистки, так как технологический регламент не может обеспечить стерильность и специфичность препарата. Поэтому нельзя исключать возможность размножения адаптивных форм возбудителя туберкулёза, которые могут поступать с туберкулином в организм животных после многократных внутрикожных введений.
Противоположное мнение высказывают В.Е. Козлов, В.М. Безгин (2004, 2006), указывая, что в технологию изготовления туберкулинов включён тест на специфическую безвредность, поскольку таково общепринятое международное требование безопасности для туберкулиновых препаратов. Готовый препарат не содержит живых возбудителей туберкулёза. Туберкулин представляет собой очищенный протеин, так называемый ППД (PPD: Purified Protein Derivate – очищенный дериват белка) туберкулиногенных штаммов возбудителя туберкулёза бычьего вида.
Учитывая актуальность проблемы этой болезни в нашей стране и имеющиеся сомнения в качестве аллергенов для диагностики туберкулёза животных, целью нашей работы было провести культуральное и ПЦР-исследование ППД-туберкулина для млекопитающих, ППД-туберкулина для птиц и сухого очищенного комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ) производства «Курской биофабрики» в целях определения возможности выявления микобактерий и ДНК микобактерий.
Материалы и методы
В работе использованы «Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих» стандартный раствор, серия №3, контроль №3;«Туберкулин очищенный (ППД) для птиц», серия 15, контроль 15; «Аллерген сухой очищенный комплексный из атипичных микобактерий (КАМ)», серия 7, контроль 7. Для культурального исследования использовали питательные среды Левенштейна-Йенсена и ФАСТ-3Л. Для ПЦР-исследования использовали тест-системы «МТБ-КОМ-FRT» для амплификации участка ДНК Mycobacterium tuberculosis complex методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, «АВИУМ» для выявления ДНК Mycobacterium avium с электрофоретической детекцией в агарозном геле. Секвенирование специфических последовательностей 16S рДНК и internal transcribed spacer [ITS] региона проводили в соответствии с алгоритмом типирования микобактерий, предложенным American Society for Microbiology. Постановку ПЦР и анализ результатов проводили на приборе RotorGene-6000 производства «CorbettResearch»(Австралия).
Для культурального и ПЦР-исследования использовали нативные растворы аллергенов, концентрат, полученный путём многократного центрифугирования каждого миллиграмма аллергенов при 12000 об/мин. в течение 15 минут с целью получения осадка, а также надосадочную жидкость (каждую пробу исследовали в трёх повторах).
Кроме того, для ПЦР-исследования были взяты смывы с поверхности питательных сред через 10, 30, 45 и 60 дней после посева аллергенов.
Культуральное исследование проводили путём посева каждой полученной пробы на 10 пробирок с питательной средой Левенштейна-Йенсена и на 10 пробирок со средой ФАСТ-3Л. Просмотр посевов проводили через каждые 3 – 5 дней в течение трёх месяцев.
Результаты проведённых исследований представлены в таблице 1.
Таблица 1. Результаты культурального и ПЦР-исследования аллергенов, применяемых при диагностике туберкулёза животных
|
Аллерген |
Культуральное исследование на питательной среде: |
ПЦР-исследование тест-системой: |
||
|
Левенштейна-Йенсена |
ФАСТ – 3Л |
«МТБ-КОМ-FRT» |
«АВИУМ» |
|
|
ППД-туберкулин для млекопитающих |
Отсутствие роста микобактерий в течение всего срока наблюдения |
ДНК возбудителей туберкулёза (M. bovis, M.tuberculosis, M.avium) не выделена |
||
|
ППД-туберкулин для птиц |
Отсутствие роста микобактерий в течение всего срока наблюдения |
|||
|
КАМ |
Отсутствие роста микобактерий в течение всего срока наблюдения |
ДНК возбудителей туберкулёза (M. bovis, M.tuberculosis, M.avium) не выделена |
||
|
Смывы с поверхности питательных сред Левенштейна-Йенсена и ФАСТ-3Л |
– |
– |
ДНК возбудителей туберкулёза (M. bovis, M.tuberculosis, M.avium) не выделена |
|
Как видно из данных таблицы 1, при культуральном и ПЦР-исследовании ППД-туберкулина для млекопитающих, ППД-туберкулина для птиц и сухого очищенного комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ) возбудители туберкулёза животных и ДНК возбудителей не обнаружены.
ППД-туберкулин для птиц и КАМ были исследованы с помощью алгоритма типирования микобактерий, предложенного American Society for Microbiology, основанного на секвинировании специфических последовательностей 16S рДНК и internal transcribed spacer [ITS] региона. Данный алгоритм позволяет обнаруживать микобактерии и определять их видовую принадлежность путем сравнения анализируемой последовательности 16S рДНК и региона ITS с аналогичными последовательностями, приведенными в международной базе данных RIDOM.
При амплификации ДНК, выделенной из КАМ и ППД-туберкулина для птиц согласно указанному протоколу, специфический ампликон получен не был, что свидетельствует об отсутствии в исследованном материале ДНК микобактерий.
Вывод
Полученные результаты культурального, ПЦР-исследования и секвинирования показывают, что ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и КАМ производства ФГУП «Курская биофабрика» не содержат возбудителей туберкулёза животных, ДНК возбудителей туберкулёза животных и ДНК нетуберкулёзных микобактерий.
Список литературы
1. Власенко, В.В. Туберкулёз в фокусе проблем современности / В.В. Власенко. – Винница: Наука, 1998. – 35 с.
2. Власенко, В.В. Экологический мониторинг при туберкулинодиагностике крупного рогатого скота / Власенко В.В., Лысенко А.П., Дзюмак М.А., Конопко И.Г., Березовский И.В., Гирич С.В. // Агроекологiчний журнал. – 2003. – №1. – С.76-79.
3. Калмыкова, М.С. Диагностическая ценность ПЦР – тест-систем при туберкулёзе животных: Автореф. дисс. канд. вет. наук: 16.00.03 / М.С. Калмыкова. – Москва, 2007. – 27 с.
4. Козлов, В.Е. Оценка эффективности и специфичности коммерческих серий туберкулина (ППД) для млекопитающих отечественного производства / Козлов В.Е., Букова Н.К., Найманов А.Х. // Ветеринарная патология. – 2004. – №1–2. – С.82-85.
5. Козлов, В.Е. Гармонизация требований к туберкулиновым препаратом с международными нормативными документами /Козлов В.Е. // Материалы международной юбилейной науч.-практ. конф., посвящённой 110-летию курской биофабрики и агробиологической промышленности России. – Курск, 2006. – С.14 – 17.
6. Международная база данных RIDOM: http://rdna4.ridom.de/mycobacteria/index.html.
