Автор:

Али Найманов

Рубрика:

Актуальные проблемы туберкулеза и паратуберкулеза животных

А.Х.Найманов, О.А.Верховский, О.А.Савицкая, Н.П.Овдиенко, Ю.Н.Федоров 

Всероссийский НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко, г. Москва

 

На современном этапе борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота, этиологическими агентами кото­рого являются M.bovis и M.tuberculosis, основой профилактических и оздоровительных мероприятий была и остается диагностика этой болезни.

При диагностике туберкулеза КРС большое зна­че­ние имеют иммунодиагностические методы, направленные на оценку функциональной активности Т-лимфоцитов. Это положение обусловлено тем, что при инфи­цировании млекопитающих M.bovis доми­нирующим яв­ляется клеточный иммунный от­вет, в который вовле­чены Т-клетки, макрофаги и цитокины.

В настоящее время основными диаг­ности­ческими ме­тодами оценки Т-клеточного иммун­ного ответа при ту­берку­лезе являются внутрикожная туберкулиновая проба (ВТП), реакция бласт­-трансформации лимфоцитов (РБТЛ) и иммуноферментный метод на ос­нове мо­нокло­наль­ных антител, предназначенный для выявления g-интер­ферона (g-ИФН) в крови инфицированных животных (g-ИФН ИФА). Все указанные методы предполагают использование ППД-туберкулина для млекопитаю­щих в качестве антигена, стимули­рующего про­лиферацию Т-клеток in vivo (ВТП) или in vitro (РБТЛ и g-ИФН ИФА).

Последние достижения в области биотехнологии и иммунохимии сделали воз­можным применение метода ИФА для выявления и количественного опреде­ления уровня цитокинов (интерлейкинов, интерферонов, клеточных факто­ров, кемокинов и др.) – продуктов секреции различных ти­пов клеток иммун­ной системы. В ряде стран это направление интенсивно развивается, и одной из наиболее показательных и успешных разработок является g-ИФН ИФА – как один из но­вых, перспективных методов при­жизненной диагностики туберкулеза.

Теоретической основой разработки g-ИФН ИФА является тот факт, что в крови зараженных туберкулезом животных присутствуют сенсибилизированные Т-лимфоциты, способные к специфическому распознаванию антиге­нов, имеющихся в ППД-туберкулине для млекопитающих. В про­цессе имму­нологического распознавания происходит стимуляция Т-клеток и, как след­ствие этого, выделение цитокина – g-интерферона, определяемого в крови ме­тодом «сэндвич»-ИФА. Обнаружение g-ИФН свидетельствует о наличии возбудителя туберкулеза в организме исследуемого животного.

Высокая чувствительность и специфичность g-ИФН ИФА была подтверждена при проведении широкомасштабных диагностических исследо­ва­ний в США, Ирландии, Испании, Аргентине, Бразилии и других странах мира [1-8].

Для получе­ния более достоверных результатов диагностических исследований на ту­беркулез большинство авторов рекомендуют использовать комплексный метод диагностики, т.е. одновременно два метода: внут­рикожную туберкулиновую пробу и g-ИФН ИФА.

В настоящее время g-ИФН ИФА наряду с ВТП является узаконенным методом диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в Австра­лии, Новой Зеландии и Румы­нии.

К сожалению, этот метод диагностики туберкулеза КРС в нашей стране не изучался.

Целью настоящей работы было изучение дина­мики содержания g-ИФН в крови экспериментально зараженных бычков и сравнительное изучение диагно­стической ценности внутрикожной туберкулиновой пробы и g-ИФН ИФА в благополуч­ных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах РФ.

Материалы и методы

Опыт с экспериментальными животными был проведен в Вышневолоцком отделе ВИЭВ (о. Лисий) на девяти телятах, сформированных в две группы (опытная и контроль­ная) по прин­ципу аналогов. Животные первой группы (n=6) были заражены вирулент­ной культурой M.bovis «8», живот­ные второй (n=3) – служили контролем. Заражение шести экспериментальных телят проводили алиментарно, четырехкратно в дозе 0,2 мг культуры M.bovis на 1 кг живого веса животного. Первые три введения культуры M.bovis (в дозе 20 мг/животное) про­водили ежедневно, четвертое – прово­дили через семь суток после третьего в той же дозе и тем же способом.

Прижизненные исследования проводили в процессе постинфекционного им­муногенеза на 0, 7, 14, 21, 28, 35, 65, 85, 110 и 135 сутки после заражения (п.з.) с использованием аллергической пробы и g-ИФН ИФА, по­смертные – сразу же после убоя животных (через год п.з.).

Изучение диагностической ценности g-ИФН ИФА было проведено в трех благополучных по туберкулезу хо­зяйствах Смоленской и Ярославской областей (хозяйства №1, 2, 3), в ко­то­рых установлена сенсибилизация особей ати­пичными микобакте­риями, и в одном неблагополучном по туберкулезу хо­зяйстве Тамбовской области (хозяйство №4).

Исследования внутрикожной туберкулиновой пробой, патологоанато­мические исследования убитых животных и лабораторные исследования патматериала от этих особей проводили в соответствии с «Наставле­нием по диагностике туберкулеза животных» (2002). Симультанную туберкулиновую пробу проводили с использованием ППД-туберку­лина для мле­копитающих и КАМ (комплексного аллергена из атипичных микобакте­рий).

Аллергические исследования и убой реагирующих животных осуществлялся совместно с представителями ветеринарной службы области, районов и ветеринарных врачей хозяйств.

После проведения аллергических исследований на туберкулез и учета реакции, кровь от реагирующих на туберкулин животных, а также от нереагирующих особей (от 5 до 20 кон­трольных животных данного хозяйства) доставляли в лабораторию иммунологии и биотехно­логии ВИЭВ. Главной сложностью при проведении указанных исследова­ний была необходимость быстрой доставки крови (в течение 24 часов по­сле взятия) для исследования и определения g-ИФН методом «сэндвич» ИФА.

В исследованиях был использован коммерческий ИФА-набор (BOVI­GAM^TM
Bovine Gamma Interferon test, CSL Veterinary, Australia), любезно предоставленный проф. J.D.Col­lins (Университет Дублина, Ирландия), а также ППД-туберкулин для млекопитающих и ППД-туберкулин для птиц зарубежного (Institute for Animal Science and Health, Нидерланды) и отечественного (ФГУП «Кур­ская биофабрика») производства. Постановку реак­ции, учет и интерпретацию полученных ре­зультатов проводили по мето­дикам, рекомендованным фирмой-производителем в нашей модифика­ции. Для постановки g-ИФН ИФА использовали: в хозяйствах №1 и №4 – оте­чественные и голландские ППД-туберкулины для млекопитающих и ППД- туберкулины для птиц, в хозяйствах №2 и №3 – только голландские препа­раты ППД-туберкулина для млекопитающих и ППД-туберкулина для птиц.

 

Результаты исследований

Результаты ИФА по определению динамики содержания g-ИФН в крови телят опытной группы в процессе постинфекционного иммуноге­неза свидетельствовали о том, что Т-клеточный иммунный ответ форми­ровался у всех экспериментально зараженных животных. Однако у опытных особей были установлены различия в сроках по­явления и относительном содержании g-ИФН в крови. Так, достоверное увеличение содержания g-ИФН в крови зарегистрировано у теленка №1 на 35-е сутки п.з., у телят №2, №4 и №6 – на 65-е сутки п.з., у теленка №5 – на 85-е сутки п.з. и у теленка №3 – на 110-е сутки п.з. соответственно. Максимальная концентра­ция g-ИФН установлена у теленка №1 на 65-е сутки п.з., у теленка №4 – на 110-е сутки п.з. и у телят №2 и №6 – на 135-е сутки п.з.

Кроме того, анализ полученных нами данных показал, что у телят в процессе постинфекционного иммуногенеза уровень g-ИФН в крови в большинстве случаев после дос­тижения своего максимального значения имел вы­раженную тенден­цию или к своему снижению (у трех животных) или к увели­чению (у двух телят).

Одновременно с проведением исследований по изучению динамики формирования постинфекционного g-ИФН – иммунного ответа у зараженных телят – нами была решена еще одна за­дача данного опыта: оценка ди­агностической ценности ВТП и g-ИФН ИФА. Анализ полученных резуль­татов позволил констатировать 100% совпадение результатов двух методов на 135-е сутки после заражения, однако диагностиче­ское повыше­ние уровня g-ИФН, установ­ленное мето­дом ИФА, происходило на 20-50 суток раньше, чем была за­регистриро­вана реакция на внутрикожное введе­ние туберкулина.

При патологоанато­мическом и гистологическом исследовании туберкулез был подтвержден у двух за­раженных телят. При бактериологиче­ском исследовании патматериала от всех подопытных животных рост культур M.bovis также обнаружили только у двух зараженных телят. Од­нако при исследовании методом ПЦР верхнего слоя засеянной питатель­ной среды во всех пробах от шести (100%) зараженных телят обнаружен возбудитель M.bovis.

Результаты посмертных и прижизненных исследований (методами ВТП и g-ИФН ИФА) живот­ных кон­трольной группы были отрицательными в течение всего эксперимента.

 

Исследования в благополучных по туберкулезу хозяйствах

В хозяйстве №1 было исследовано внутрикожной туберкулиновой пробой 274 головы крупного рогатого скота. При учете реакции выявлено пять реагирующих на туберкулин животных с утолщением кожной складки на 4-6 мм. От всех реагирующих на туберкулин особей и 15 нереаги­рующих на туберкулин животных были отобраны пробы крови и исследо­ваны методом g-ИФН ИФА.

При учете результатов исследований у 15 нереагирующих на туберку­лин (контрольных) особей получены отрицательные показа­тели и в g-ИФН ИФА. Из них две коровы реагировали на ППД-туберку­лина для птиц, что является показателем неспецифической сенсибилизации животных. Тот факт, что эти коровы не реагировали на внутрикожное введение ППД-туберкулина для млекопитающих, можно объяснить тем, что, возможно, они реагировали на внутрикожное введение ППД- туберкулина для птиц или же КАМ. Однако, к сожалению, в этом хозяйстве аллергиче­ские исследования проводили только внутрикожным введением ППД-ту­беркулина для млекопитающих.

При учете и интерпретации результатов g-ИФН ИФА цифровые значе­ния показателей ОП 450 В-А находились в пределах 0,043-0,036. У двух коров, реагирующих на ППД-туберкулин для птиц, эти показатели составили 0,51 и 0,24 соответственно.

Все пять реагирующих на внутрикожную туберкулиновую пробу животных показали отрицательный результат в g-ИФН ИФА (значения показателей ОП 450 В-А составляли 0,043-0,046 соответственно).

При этом было установлено 100% совпадение результатов реакций, полученных с использованием голландских и отечественных ППД-туберкулинов для млекопитающих и птиц.

Кроме того, наблюдалась положительная корреляция в цифровых значениях показателей ОП 450 В-А, полученных с использованием данных препаратов (r = 0,7, Р < 0,05).

По результатам исследований в хозяйстве № 1 провели диагностический убой трех реагирующих на внутрикожное введение туберкулина коров (с отрицательными показателями в g-ИФН ИФА).

При патологоанатомическом осмотре убитых особей характерных для туберкулеза изменений не обнаружили ни в одном случае. При лаборатор­ном исследовании патматериала от убитых коров возбудителя туберкулеза не выделили. Выделили быстрорастущие атипичные микобактерии IV группы по классификации Раньена.

В хозяйстве №2 плановые исследования на туберкулез проводили симультанной туберкулиновой пробой с использованием ППД-туберкулина для млекопитающих и КАМ.

При исследовании 287 голов крупного рогатого скота выявлено 55 реагирующих на туберкулин животных, из них с большей интенсивностью реакции на ППД-туберкулин для млекопитающих – 15 (знак +), с меньшей реакцией – 29 (знак -), с равной реакцией – 11 (знак =). Результат симультанной пробы неопределенный.

От этих 55 реагирующих животных и 5 нереагирующих животных хозяйства были взяты пробы крови и исследованы методом g-ИФН ИФА.

При учете реакции проб крови от 5 нереагирующих на туберкулин особей в g-ИФН ИФА были получены отрицательные результаты (показатели ОП 450 В-А в пределах 0,007-0,057).

При исследовании проб крови от 55 реагирующих коров методом g-ИФН ИФА получены следующие результаты: 18 – положительных (показатели ОП 450 В-А 0,128-1,3), 37 – отрицательных (0,029-0,081), из кото­рых 3 реагировали на ППД- туберкулин для птиц (0,133; 0,221 и 1,178 соответственно).

Совпадение результатов исследований двух диагностических тестов было установлено у шести (40%) животных с положительными показаниями и у 20 (68,9%) особей с отрицательными показаниями. Из 11 животных с равной реакцией на ППД-туберкулин для млекопитающих и КАМ трое дали положительную, восемь же – отрицательную реакцию в g-ИФН ИФА.

По результатам проведенных исследований в хозяйстве № 2 провели диагностический убой трех реагирующих коров, реагировавших в большей степени на ППД-туберкулин для млекопитающих и давших положительные показания в g-ИФН ИФА. При патологоанатомическом осмотре у убитых особей не обнаружили характерных для туберкулеза изменений. Даль­нейшие лабораторные исследования патматериала от убитых животных также дали отрицательный результат.

Полученные результаты исследований показывают, что в стадах с сильной степенью сенсибилизации животных атипичными микобактериями g-ИФН ИФА также дает ложноположительные результаты. Тем не менее, отрицательно реагирующих животных по g-ИФН ИФА гораздо больше (29 – по симультанной пробе, 37 – по g-ИФН ИФА). Также следует отметить тот факт, что при применении g-ИФН ИФА нет категории особей «с равной реакцией», то есть, учитывая полученные результаты иссле­дований, есть основание предлагать g-ИФН ИФА в качестве дополнитель­ного диагностического теста для дифференциации неспецифических реак­ций на туберкулин при диагностике туберкулеза у крупного рогатого скота.

В хозяйстве № 3 при исследовании внутрикожной туберкулиновой пробой 739 голов КРС было выявлено 24 реагирующих на туберкулин животных с увеличением толщины кожной складки на 3-6 мм. От всех 24 реагирующих коров и еще 11 нереагирующих на туберкулин были отобраны пробы крови, которые исследованы методом g-ИФН ИФА.

При учете результатов исследований у 11 нереагирующих на туберкулин (контрольных) животных получены отрицательные показания в g-ИФН ИФА (ОП 450 В-А от 0,053 до 0,046). 24 реагировавшие на туберку­лин коровы дали отрицательные результаты в g-ИФН ИФА (ОП 450 В-А от 0,022 до 0,076). Две из них реагировали на ППД-туберкулин для птиц (0,11 и 0,896 соответственно).

По результатам исследований провели диагностический убой пяти реагировавших на туберкулин и не реагировавших в g-ИФН ИФА особей. При патологоанатомическом осмотре убитых коров характерных для туберкулеза изменений не обнаружили. При лабораторном исследовании патматериала от убитых животных возбудителя не выделили. Выделили нефотохромогенные атипичные микобактерии III группы по классификации Раньена.

 

Исследования в неблагополучном по туберкулезу хозяйстве

В неблагополучном по туберкулезу хозяйстве при исследовании 696 голов крупного рогатого скота было выявлено 16 реагирующих на туберкулин животных. Все реагирующие на туберкулин были убиты на мясокомбинате и подвергнуты патологоанатомическому исследованию. От всех убитых коров были отобраны пробы крови и исследованы методом g-ИФН ИФА с применением отечественных и голландских ППД-туберкулинов для млекопитающих и ППД-туберкулинов для птиц.

При патологоанатомическом осмотре убитых коров характерные для туберкулеза изменения были обнаружены в двух случаях.

При исследовании 16 проб крови в g-ИФН ИФА результаты исследований были положительными в 13 случаях (показатели ОП 450 В-А со­ставляли от 0,167 до 2,342 после инкубации с различными антигенами). В трех случаях получен отрицательный результат (от 0,078 до 0,031).

Следует отметить, что в g-ИФН ИФА с ППД-туберкулином для птиц ни одно животное не дало положительной реакции.

Кроме того, установлено, что при трехкратном исследовании каждой пробы крови наблюдалось 100% совпадение в интерпретации результа­тов g-ИФН ИФА с использованием голландских и отечественных ППД- туберкулинов для млекопитающих и ППД-туберкулинов для птиц.

Однако в ряде случаев, при проведении однократных исследований, несмотря на статистически достоверную положительную корреляцию результатов (r = 0,65, Р < 0,05), наблюдались цифровые расхождения показа­телей ОП 450 В-А, полученные с применением двух препаратов.

При этом в большинстве случаев показатели ОП 450 А и ОП 450 В были значительно выше при использовании отечественных ППД-туберкулинов для млекопитающих и ППД-туберкулинов для птиц.

При лабораторном исследовании патматериала от убитых животных туберкулез подтвержден еще у пяти реагировавших убитых коров.

При патологоанатомическом осмотре и лабораторном исследовании патматериала от трех реагировавших на внутрикожное введение туберкулина животных, не давших впоследствии положительный результат в g-ИФН ИФА, ту­беркулез не подтвержден ни в одном случае.

 

Выводы

1. Отработан метод «сэндвич» ИФА, предназначенный для обнаружения g-ИФН в пробах крови крупного рогатого скота, который обладает высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью ре­зультатов.

2. На экспериментально зараженных M.bovis телятах установлена максимальное (100%) совпадение результатов исследований внут­рикожной туберкулиновой пробой и g-ИФН ИФА на 135-е сутки после за­ражения.

3. В благополучных по туберкулезу хозяйствах, где уста­новлена сенсибилизация животных атипич­ными микобактериями, g-ИФН ИФА дает в три раза меньше ложноположительных результатов, по сравнению с внутри­кожной туберкулиновой пробой.

4. В неблагополучных по туберкулезу хозяйствах результаты исследований с применением внутрикожной туберкулиновой пробы и g-ИФН ИФА совпадают в 81,2% случаях.

5. Недостатками метода g-ИФН ИФА являются необходимость исследования свежей крови (в течение 24 часов после взятия) и относительная доро­говизна проведения исследований, по сравнению с внутрикожной туберку­линовой пробой.

Заключение

g-ИФН ИФА целесообразно использовать как дополнительный метод для прижизненных исследований на туберкулез крупного рогатого скота в целях дифференциации аллергических реакций на туберкулин.

Список литературы

1.                 Gonzalez Llamazares O. R., Gutierrez Martin C.B., Alvares Nistal D. et al. // Vet. Microbiol., 1999, 70, 55-66.

2.                 Katial R. K., Hershey J., Purohit-Seth T. et al. // Clin. Diagn. Lab. Immu­nol., 2001, 8:339-345.

3.                 Monaghan M., Quinn P.J., Kelly A.P. et al. // Irish Vet. J., 1997, 50, 229-232.

4.                 Rhodes S.G., Hewinson R.G., Vordermeier H.M. // J.Immunology, 2001, 166: 5604-5610.

5.                 Rojas R., Balaji K. N., Subramanian A., Boom W. H. // Infect. Immun., 1999, 67: 6461-6465.

6.                 Smyth A. J., Welsh M. D., Girvin R. M. and Pollock J. M. // Infect. Im­mun. 2001, 69:5889-5896.

7.                 Wedlock D.N, Vesosky B., Skinner M.A. et al. // Infect. Immun., 2000, 68:5809-5815.

8.                 Whipple D.L., Bolin C.A., Davis A.J. et al. // Am. J. Vet. Res., 1995, 56 (4), 415-419.

 

• ИФА
• туберкулез
• диагностика