Диагностическое значение внутрикожной туберкулиновой пробы и g-ИФН ИФА при туберкулезе КРС

А.Х.Найманов, О.А.Верховский, О.А.Савицкая

Всероссийский НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко, г. Москва

На современном этапе борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота ос­новой профилактических и оздоровительных мероприя­тий остается диагностика этой болезни.

При диагностике туберкулеза КРС большое зна­че­ние имеют иммунодиагностические методы, направленные на оценку функциональной ак­тивности Т-лимфоцитов. Это положение обусловлено тем, что при инфи­цировании млекопитающих M.bovis доми­нирующим является клеточный иммунный от­вет. Дальнейшие исследования по изучению туберкулеза чело­века, крупного рогатого скота и других видов живот­ных подтвердили эту концепцию (P.R.Wood, J.S.Rothel, 1994; S.D. Neill et al., 1994 и др.).

Основными диагностическими методами оценки Т-клеточного иммун­ного ответа при туберкулезе являются внутрикожная туберкулиновая проба (ВТП), реакция бласт-трансформации лимфоцитов (РБТЛ) и разрабо­танный сравнительно недавно (J.S.Rothel et al., 1990) «сэндвич»-ИФА на основе мо­ноклональных антител, предназначенный для выявления g-ин­терферона (g-ИФН) в крови инфицированных животных (g-ИФН ИФА). Все методы пред­полагают использование ППД-туберкулина в качестве ан­тигена, стимули­рующего пролиферацию Т-клеток in vivo (ВТП) или in vi­tro (РБТЛ и g-ИФН ИФА).

Достижения в области биотехнологии и иммунохимии сделали возможным применение метода ИФА для выявления и количест­венного опре­де­ления уровня цитокинов (интерлейкинов, интерферонов, клеточных фак­то­ров, кемокинов и др.)  – продуктов секреции различных ти­пов клеток им­мун­ной системы. Это направление интенсивно развивается, и одной из наиболее показательных и успешных разработок является g-ИФН ИФА – как один из но­вых, пер­спективных методов при­жизненной диагностики туберкулеза.

Теоретической основой разработки g-ИФН ИФА является тот факт, что в крови зараженных туберкулезом животных присутствуют сенсибилизиро­ванные Т-лимфоциты, способные к специфическому распознаванию антиге­нов, имеющихся в ППД-туберкулине для млекопитающих. В про­цессе имму­нологического распознавания происходит стимуляция Т-клеток и, как след­ствие этого, выделение цитокина  – g-интерферона, определяемого в крови ме­тодом «сэндвич»-ИФА. Обнаружение g-ИФН свидетельствует о наличии возбудителя туберкулеза в организме исследуемого животного. Для получе­ния более достоверных результатов прижизненных диагности­ческих ис­следований на это заболевание большинство авторов рекомендуют использо­вать комплексный метод диагностики, т.е. одновременно два ме­тода: внутрикожную туберкулиновую пробу и g-ИФН ИФА.

Высокая чувствительность и специфичность g-ИФН ИФА была подтверждена при проведении диагностических исследова­ний в США, Ирлан­дии, Испании, Аргентине, Бразилии и других странах мира (D.L.Whipple et al., 1995, 2001; M.Monaghan et al., 1997; O. R.Gonzalez Llamazares et al., 1999; T.J.Ryan et al., 2000; J.M.Pollock et al., 2000; B.M.Buddle et al., 2001; R.K.Katial et al., 2001 и др.). К сожалению, в нашей стране этот метод не изучался и известен только по зарубежным публикациям. Поэтому во­просы, связанные с изучением Т-клеточного иммунного ответа при тубер­кулезе крупного рога­того скота, и возможности использования g-ИФН ИФА для диагностики этой болезни в РФ являются весьма актуальными.

Целью настоящей работы было сравнительное изу­чение диагно­стической ценности внутрикожной туберкулиновой пробы и g-ИФН ИФА в благополуч­ных и неблагополучных по туберкулезу хозяй­ствах России.

Материалы и методы

Исследования были проведены в трех благополучных по туберкулезу хо­зяйствах Смоленской и Яро­слав­ской областей (хозяйства №1, 2, 3), в кото­рых установлена сенсибилизация животных ати­пичными микобактериями, а также в одном неблагополучном по туберкулезу хозяйстве Тамбовской области (хозяйство №4).

Исследования внутрикожной туберкулиновой пробой, патологоанато­мические исследования убитых животных и лабораторные анализы пат­материала от этих особей проводили в соответствии с «Наставле­нием по диагностике туберкулеза животных» (2002). Симультанную тубер­кулиновую пробу проводили с использованием ППД-туберку­лина для мле­копитающих и КАМ (комплексного аллергена из атипичных микобакте­рий).

Аллергические исследования и убой реагирующих животных осуществляли совместно с представителями ветеринарной службы области, районов и ветеринарных врачей хозяйств.

После проведения аллергических исследований на туберкулез и учета реакции кровь от реагирующих на туберкулин животных, а также от нереагирующих особей (от 5 до 20 животных данного хозяйства – контрольная группа) доставляли в лабораторию иммунологии и биотехнологии ВИЭВ. Главной сложностью при проведении указанных исследова­ний была необходимость быстрой доставки крови (в течение 24 часов по­сле взятия) для изучения и определения g-ИФН методом «сэндвич» ИФА.

В исследованиях был использован коммерческий ИФА-набор (BOVI­GAM^TM
Bovine Gamma Interferon test, CSL Veterinary, Australia), любезно предоставленный проф. J.D.Col­lins (Университет Дублина, Ирландия), а также ППД-туберкулин для млекопитающих и ППД-туберкулин для птиц зарубежного (Institute for Animal Science and Health, Нидерланды) и отечественного (ФГУП «Кур­ская биофабрика») производства. Постановку про­водили по мето­дикам, рекомендованным фирмой-производителем в нашей модифика­ции. Результаты ИФА оценивали с помощью фотометра «Multiskan MCC/340» («Labsystems», Финляндия) при длине волны 450 нм по коэффициенту оптического поглощения (ОП 450). Значе­ния ОП 450 каждой испытуемой пробы, исследуемой как О (после инкубации с фосфатным буфером), А (после инкубации с ППД-туберкулином для птиц) и В (после инку­бации с ППД-туберкулином для млекопитающих) были исполь­зованы для анализа и интерпретации полученных результатов.

Результаты g-ИФН ИФА интерпретировали согласно схеме, рекомендованной фирмой-производителем:

Положительный результат: ОП 450 B – ОП 450 О > 0,1 и

 ОП 450 B – ОП 450 A > 0,1

Отрицательный результат: ОП 450 B – ОП 450 О < 0,1 или

 ОП 450 B – ОП 450 A < 0,1

Если разница между ОП 450 A и ОП 450 О превышала 0,1 и при этом разница между ОП 450 A – ОП 450 B также превышала 0,1, то ре­зультат счи­тался отрицательным с пометкой «Реакция на ППД-туберкулин для птиц».

Для постановки g-ИФН ИФА использовали: в хозяйствах №1 и №4 – оте­чественные и голландские ППД-туберкулины для млекопитающих и ППД-туберкулины для птиц, в хозяйствах №2 и №3 – только голландские препа­раты ППД-туберкулина для млекопитающих и ППД-туберкулина для птиц.

Результаты исследований

Исследования в благополучных по туберкулезу хозяйствах

В хозяйстве №1 было исследовано внутрикожной туберкулиновой пробой 274 головы крупного рогатого скота. При учете реакции выявлено пять реагирующих на туберкулин животных с утолщением кожной складки на 4-6 мм. От всех реагирующих на туберкулин особей и 15 нереаги­рующих на туберкулин животных были отобраны пробы крови и исследо­ваны методом g-ИФН ИФА.

При учете результатов исследований у 15 нереагирующих на туберку­лин (контрольных) животных получены отрицательные показа­тели и в g-ИФН ИФА. Из них две коровы реагировали на ППД-туберку­лин для птиц, что является показателем неспецифической сенсибилизации. Тот факт, что эти коровы не реагировали на внутрикожное вве­дение ППД- туберкулина для млекопитающих, можно объяснить тем, что, возможно, они реагировали на внутрикожное введение ППД-туберкулина для птиц или же КАМ. Однако, к сожалению, в этом хозяйстве, аллергиче­ские исследования проводили только внутрикожным введением ППД-туберкулина для млекопитающих.

При учете и интерпретации результатов g-ИФН ИФА цифровые значе­ния показателей ОП 450 В-А находились в пределах 0,043-0,036. У двух коров, реагирующих на ППД-туберкулин для птиц, эти показатели составили -0,51 и -0,24 соответственно.

Все пять реагирующих на внутрикожную туберкулиновую пробу животных показали отрицательный результат в g-ИФН ИФА (значения показателей ОП 450 В-А составляли 0,043 – 0,046 соответственно).

При этом было установлено 100% совпадение результатов реак­ции, полученных с использованием голландских и отечественных ППД- туберкулинов для млекопитающих и птиц.

Кроме того, наблюдалась положительная корреляция в цифровых значениях показателей ОП 450 В-А, полученных с использованием данных препаратов (r = 0,7, Р < 0,05).

По результатам исследований в хозяйстве №1 провели диагностический убой трех реагирующих на внутрикожное введение туберкулина коров (с отрицательными показателями в g-ИФН ИФА).

При патологоанатомическом осмотре убитых животных характерных для туберкулеза изменений не обнаружили ни в одном случае. При лаборатор­ном исследовании патматериала от убитых коров возбудителя туберкулеза не выделили. Выделили быстрорастущие атипичные микобактерии IV группы по классификации Раньена.

В хозяйстве №2 плановые исследования на туберкулез проводили симультанной туберкулиновой пробой с использованием ППД-туберкулина для млекопитающих и КАМ.

При исследовании 287 голов крупного рогатого скота выявлено 55 реагирующих на туберкулин животных, из них с большей интенсивностью реакции на ППД-туберкулин для млекопитающих – 15 (знак +), с меньшей реакцией – 29 (знак -), с равной реакцией – 11 (знак =). Результат симультанной пробы неопределенный.

От этих 55 реагирующих и пяти нереагирующих животных хозяйства были взяты пробы крови и исследованы методом g-ИФН ИФА.

При учете реакции проб крови от пяти нереагирующих на туберкулин животных в g-ИФН ИФА были получены отрицательные результаты (пока­затели ОП 450 В-А в пределах 0,007-0,057).

При исследовании проб крови от 55 реагирующих коров методом g-ИФН ИФА получены следующие результаты: 18 – положительных (показатели ОП 450 В-А 0,128-1,3), 37 – отрицательных (0,029-0,081), из кото­рых три реагировали на ППД-туберкулин для птиц (-0,133; -0,221 и -1,178 со­ответственно).

Совпадение результатов исследований двух диагностических тестов было установлено у шести (40%) животных с положительными показаниями и у 20 (68,9%) животных с отрицательными показаниями. Из 11 особей с равной реакцией на ППД-туберкулин для млекопитающих и КАМ, три дали положительную, а 8 – отрицательную реакцию в g-ИФН ИФА.

По результатам проведенных исследований в хозяйстве № 2 провели диагностический убой трех коров, реагировавших в большей степени на ППД-туберкулин для млекопитающих и давших положитель­ные показания в g-ИФН ИФА. При патологоанатомическом осмотре у уби­тых коров не обнаружили характерных для туберкулеза изменений. Даль­нейшие лабораторные исследования патматериала от убитых животных также дали отрицательный результат.

Полученные результаты исследований показывают, что в стадах с сильной степенью сенсибилизации животных атипичными микобактериями g-ИФН ИФА также дает ложноположительные результаты. Тем не менее, отрицательно реагирующих животных по g-ИФН ИФА гораздо больше (29 – по симультанной пробе, 37 – по g-ИФН ИФА). Также следует отметить тот факт, что при применении g-ИФН ИФА нет категории живот­ных «с равной реакцией», то есть, учитывая полученные результаты иссле­дований, есть основание предлагать g-ИФН ИФА в качестве дополнитель­ного диагностического теста для дифференциации неспецифических реак­ций на туберкулин при диагностике туберкулеза у крупного рогатого скота.

В хозяйстве №3 при исследовании внутрикожной туберкулиновой пробой 739 голов КРС было выявлено 24 реагирующих на туберкулин животных с увеличением толщины кожной складки на 3-6 мм. От всех 24 реагирующих коров и 11 нереагирующих на туберкулин были отобраны пробы крови и исследованы методом g-ИФН ИФА.

При учете результатов исследований у 11 нереагирующих на туберкулин (контрольных) особей получены отрицательные показания в g-ИФН ИФА (ОП 450 В-А от 0,053 до 0,046). 24 реагировавшие на туберкулин коровы дали отрицательные результаты в g-ИФН ИФА (ОП 450 В-А от 0,022 до 0,076). Две из них реагировали на ППД-туберкулин для птиц (-0,11 и -0,896 соответственно).

По результатам исследований провели диагностический убой пяти реагировавших на туберкулин и не реагировавших в g-ИФН ИФА коров. При патологоанатомическом осмотре убитых характерных для ту­беркулеза изменений не обнаружили. При лабораторном исследовании патматериала от этих особей возбудителя туберкулеза не выделили. Выделили нефотохромогенные атипичные микобактерии III группы по классификации Раньена.

Исследования в неблагополучном по туберкулезу хозяйстве 

В неблагополучном по туберкулезу хозяйстве при исследовании 696 голов крупного рогатого скота было выявлено 16 реагирующих на туберкулин животных. Все реагирующие животные были убиты на мясокомбинате и подвергнуты патологоанатомическому исследованию. От всех убитых коров были отобраны пробы крови и исследованы методом g-ИФН ИФА с применением отечественных и голландских ППД-туберкулинов для млекопитающих и ППД-туберкулинов для птиц.

При патологоанатомическом осмотре убитых коров характерные для туберкулеза изменения были обнаружены в двух случаях.

При исследовании 16 проб крови в g-ИФН ИФА результаты исследований были положительными в 13 случаях (показатели ОП 450 В-А со­ставляли от 0,167 до 2,342 после инкубации с различными антигенами). В трех случаях получен отрицательный результат (от 0,078 до 0,031).

Следует отметить, что в g-ИФН ИФА с ППД-туберкулином для птиц ни одно животное не дало положительной реакции.

Кроме того установлено, что при трехкратном исследовании каждой пробы крови наблюдалось 100% совпадение в интерпретации результа­тов g-ИФН ИФА с использованием голландских и отечественных ППД-туберкулинов для млекопитающих и ППД-туберкулинов для птиц.

Однако в ряде случаев при проведении однократных исследований, несмотря на статистически достоверную положительную корреляцию результатов (r = 0,65, Р < 0,05), наблюдались цифровые расхождения показа­телей ОП 450 В-А, полученных с применением двух препаратов.

При этом в большинстве случаев показатели ОП 450 А и ОП 450 В были значительно выше при использовании отечественных ППД-туберкулинов для млекопитающих и ППД-туберкулинов для птиц.

При лабораторном исследовании патматериала от убитых животных туберкулез подтвержден еще у пяти реагировавших убитых коров.

При патологоанатомическом осмотре и лабораторном исследовании патматериала от трех реагировавших на внутрикожное введение туберкулина особей, не давших положительный результат в g-ИФН ИФА, ту­беркулез не подтвержден ни в одном случае.

Выводы

1. Отработан метод «сэндвич» ИФА, предназначенный для обнаружения g-ИФН в пробах крови крупного рогатого скота. Метод обладает высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью ре­зультатов.

2. Недостатками g-ИФН ИФА является необходимость иссле­дования свежей крови (в течение 24 часов после взятия) и относительная дороговизна проведения исследований, по сравнению с внутрикожной туберку­линовой пробой.

Заключение 

g-ИФН ИФА целесообразно использовать как дополнительный метод для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в целях дифференциации неспецифических реакций на туберкулин.

Список использованной литературы

1.                 Buddle BM, Ryan TJ, Pollock JM, Andersen P, de Lisle GW. Use of ESAT-6 in the interferon-gamma test for diagnosis of bovine tuberculosis following skin testing. — Vet Microbiol., 2001, 80 (1):37-46.

2.                 Gonzalez Llamazares O. R., Gutierrez Martin C.B., Alvares Nistal D. et al. Field evaluation of the single intradermal cervical tuberculin test and the inter­feron-g assay for detection and eradication of bovine tuberculosis in Spain.- Vet. Microbiol., 1999, 70, 55-66.

3.                 Katial, R. K., J. Hershey, T. Purohit-Seth, J. T. Belisle, P. J. Brennan, J. S. Spencer, and R. J. M. Engler. 2001. Cell-mediated immune response to tuberculo­sis antigens: comparison of skin testing and measurement of in vitro gamma inter­feron production in whole-blood culture. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8:339-345.

4.                 Monaghan M., Quinn P.J., Kelly A.P. et al. A pilot trial to evaluate the g-inter­feron assay for the detection of Mycobacterium bovis infected cattle under Irish conditions.- Irish Vet. J., 1997, 50, 229-232.

5.                 Neill S.D., Cassidy J., Hanna J. et al. Detection of Mycobacterium bovis infec­tion in skin-test negative cattle with an assay for bovine gamma-interferon. — Vet. Record, 1994, 135, 134-135.

6.                 Pollock JM, Girvin RM, Lightbody KA, Clements RA, Neill SD, Buddle BM, Andersen P. Assessment of defined antigens for the diagnosis of bovine tu­berculosis in skin test-reactor cattle. – Vet. Rec., 2000, 146(23): 659-65.

7.                 Rothel J.S., Jones S.L., Corner L.A. et al. A sandwich enzyme immunoassay for bovine interferon-g and its use for the detection of tuberculosis in cattle.- Aust. Vet. J., 1990, 67, 134-137.

8.                 Ryan TJ, Buddle BM, De Lisle GW. An evaluation of the gamma interferon test for detecting bovine tuberculosis in cattle 8 to 28 days after tuberculin skin testing. – Res. Vet. Sci., 2000, 69 (1): 57-61.

9.                 Whipple D.L., Bolin C.A., Davis A.J. et al. Comparison of the sensitivity of the caudal fold skin test and a commercial g-interferon assay for diagnosis of bovine tuberculosis.- Am. J. Vet. Res., 1995, 56 (4), 415-419.

10.            Wood P.R, Rothel J.S. In vitro immunodiagnostic assays for bovine tuberculo­sis. — Vet. Microbiol., 1994, 40, 125-135.

• туберкулез
• диагностика
• ИФА