Модификация симультанной аллергической пробы для индивидуального учёта результатов диагностики
Али Найманов
Владимир Егорович Козлов, д.б.н., заместитель генерального директора по науке;
Вячеслав Михайлович Безгин, д.б.н., профессор, генеральный директор;
Юрий Михайлович Мясоедов, к.б.н., микробиолог ОБТК;
Нина Николаевна Быкова, к.б.н., начальник иммунодиагностической лаборатории НПЦ;
Лидия Давидовна Ничвеева, начальник лаборатории туберкулёза и туберкулинодиагностики НПЦ;
фгуп «Курская биофабрика», 305004, г. Курск, ул. Разина, 5,
тел. (4712) 70-06-70, e-mail: biok@biok.ru
Али Хусинович Найманов, д.в.н., профессор, заведующий лабораторией микобактериозов.
ВИЭВ, 109428, г. Москва, Рязанский проспект, д. 24, корпус 1, тел. (495) 970-03-69; e-mail: viev@mail.ru
На модели морских свинок, сенсибилизированных микобактериями разного вида, предложен вариант постановки симультанной пробы, позволяющий проводить индивидуальный учёт результатов реакции ГЗТ.
Для прижизненной дифференциальной аллергической диагностики туберкулёза у животных применяется симультанная внутрикожная проба, заключающаяся в сравнительной оценке уровней развития реакций гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на одновременно вводимые животному аллергены, выделенные из микобактерий различных видов. Определив достоверно более высокий уровень реакции на один из аллергенов, можно сделать вывод о виде микобактерий, сенсибилизировавших макроорганизм.
Согласно действующему наставлению по диагностике туберкулёза животных [1], при постановке симультанной пробы животным вводят по одной дозе туберкулина (ППД) для млекопитающих и комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ). Как вариант, вместо КАМ допускается применение туберкулина (ППД) для птиц.
Уровень сенсибилизации животных антигенами возбудителей значительно варьируется, вследствие чего возникают парадоксальные (сомнительные) реакции, что затрудняет определение сенсибилизирующего агента в конкретном случае. Поэтому симультанная проба считается групповой и даёт возможность ориентироваться в ситуации по туберкулёзу лишь в целом по стаду или группе не менее шести голов [1].
Целью исследования явилась разработка варианта постановки реакции ГЗТ, позволяющего снизить влияние индивидуальных различий и надёжно определять вид микобактерий, сенсибилизировавших данное животное.
Материалы и методы. Эксперименты проводили на сформированных в группы морских свинках, сенсибилизированных различными видами микобактерий: M. bovis (штамм BCG-1), M. avium (штамм 2282), смесью культур атипичных микобактерий (штаммы M. scrofulaceum 12-S и M. intracellulare 13-N). Для оценки сенсибилизации животных использовали коммерческие аллергодиагностикумы: туберкулин (ППД) для млекопитающих; туберкулин (ППД) для птиц, КАМ.
В сомнительных случаях при сравнении активности аллергенов проводили расчёт, основанный на функции линейной зависимости величины ответной реакции от логарифма дозы введения [2].
Логарифм относительной активности препарата (lgR) рассчитывали по формуле:
, где
d1 – величина ответной реакции (мм) на первый аллерген;
d2 – величина ответной реакции (мм) на второй аллерген;
К – сумма слагаемых в числителе (в данном случае, это два);
b – усреднённый тангенс угла наклона прямых к горизонтальной оси (прямых зависимости ответной реакции от логарифма дозы туберкулина при графическом изображении результатов) находили по формуле:
, где
D – доза вводимого аллергена.
Относительную активность (R) определяли по формуле: R=10lgR.
Результаты исследований. В первой части исследования был проведён эксперимент по постановке симультанной пробы на морских свинках, сенсибилизированных M. bovis (n = 12) и смесью культур атипичных микобактерий (n = 12). У каждого животного попарно сравнивали величины реакции ГЗТ на введение 4 ЕД КАМ – 10 МЕ туберкулина (ППД) для млекопитающих и 20 ЕД КАМ – 50 МЕ туберкулина (ППД) для млекопитающих. Вышеуказанные дозы аллергенов выбраны, потому что на морских свинках, сенсибилизированных гомологичными микобактериями, они обеспечивают хорошо читаемые реакции и, что более важно, содержат равные количества белка, соответственно, 1 и 5 мкг. Результаты отображены ниже.
Интенсивность кожных реакций ГЗТ
на введение туберкулина (ППД) для млекопитающих и КАМ
Диаметр эритемы (мм):
№ Сенсибилизирующий ППДмлек КАМ ППДмлек КАМ
морской агент 50 МЕ 20 МЕ 10 МЕ 4 МЕ
свинки Содержание белка в дозе введения
5 мкг 5 мкг 1 мкг 1мкг
1 25,0 > 13,0 17,5 > 10,0
2 21,0 > 0 15,0 > 0
3 20,0 > 0 16,0 > 13,0
4 21,0 > 13,5 14,5 > 10,0
5 21,5 > 12,5 15,5 > 8,5
6 M. bovis 26,0 > 10,5 12,5 > 0
7 (штамм BCG-1) 18,0 > 0 14,5 > 0
8 18,0 > 15,0 13,0 > 11,0
9 17,5 > 12,5 17,0 > 0
10 16,0 > 11,5 16,5 > 0
11 19,0 > 14,0 14,0 > 0
12 17,5 > 12,0 12,5 > 11,0
13 12,5 < 17,0 8,0 < 15,5
14 13,0 < 17,5 9,5 < 14,0
15 13,0 < 15,5 11,5 > 10,5
16 Атипичные 11,5 < 12,5 10,0 < 11,0
17 микобактерии 13,5 < 17,0 0 < 11,0
18 (M.scrofulaceum 12,0 < 14,5 10,0 < 12,5
19 12-S 13,5 < 17,0 0 < 13,5
20 M.intracellulare 0 < 14,0 0 = 0
21 13-N) 12,0 < 15,5 10,0 < 11,0
22 13,0 = 13,0 10,5 = 10,5
23 12,0 < 15,0 0 < 9,0
24 13,0 < 16,0 10,0 < 11,0
Как видно из результатов, большинство используемых в опыте животных реагировали на оба диагностикума. При этом диаметры на гомологичный аллерген были, как правило, больше, чем на гетерологичный. Из общего ряда выпали результаты реакции ГЗТ у двух морских свинок, сенсибилизированных атипичными микобактериями. Эти реакции интерпретировали как сомнительные.
Для определения вида микобактерий, сенсибилизировавших каждое из опытных животных, использовали графический учёт результатов, предложенный Директивой ЕС [3]. Точки графика строили как пересечение значений диаметров реакций ГЗТ у данного животного, полученных при введении парных доз аллергенов (равных по содержанию белка). По вертикали отложено значение диаметра реакций на КАМ, по горизонтали – значение диаметра реакций на туберкулин (ППД) для млекопитающих. Диагональ, проведённая из нулевой точки под углом 45 º, делит плоскость графика на две зоны: справа оказываются результаты в тех случаях, когда ответная реакция на введение туберкулина (ППД) для млекопитающих (значение по горизонтальной оси) больше ответной реакции на введение КАМ; слева, соответственно, когда ответная реакция на введение КАМ (значение по вертикальной оси) больше ответной реакции на туберкулин (ППД) для млекопитающих. Таким образом, по расположению относительно диагонали графика точек пересечения значений диаметров ответных реакций у морской свинки на введение аллергенов можно определить природу агента, инфицировавшего конкретное животное.
Как видно из рисунка 1, результаты реакций в большинстве случаев позволили сделать вывод о виде микобактерий, инфицировавших организм животного. Однако у морской свинки № 15, сенсибилизированной атипичными микобактериями, точки пересечения значений диаметров реакций ГЗТ на аллергены располагались по разные стороны от диагонали графика. С использованием стандартных методов расчёта, основанных на линейной зависимости уровня реакции ГЗТ от логарифма дозы введения [4], мы определили коэффициент активности КАМ относительно туберкулина (ППД) для млекопитающих у морской свинки № 15. Его величина составила 1,45, то есть в данном случае КАМ оказался активнее туберкулина (ППД) для млекопитающих практически в полтора раза, что позволило сделать вывод о более высоком уровне сенсибилизации данного животного антигенами атипичных штаммов микобактерий. На рисунке 2 представлены прямые зависимости выраженности ответных реакций ГЗТ на введение аллергенов у морской свинки № 15.
То есть, использование двух доз введения аллергенов при постановке симультанной пробы позволило в сомнительном случае определить более активный аллерген (КАМ), который соответствовал виду микобактерий (смесь штаммов атипичных микобактерий), использованных при сенсибилизации данного животного.
У морской свинки № 22, сенсибилизированной атипичными микобактериями, реакции ГЗТ на равные по содержанию белка дозы туберкулина (ППД) для млекопитающих и КАМ не отличались по интенсивности. Учитывая, что у животных, сенсибилизированных M. bovis, реакции на туберкулин (ППД) для млекопитающих абсолютно во всех случаях были больше, чем реакции на КАМ, равные по диаметру реакции на аллергены указывают на сенсибилизацию животного № 22 атипичными микобактериями.
Таким образом, при использовании равных по содержанию белка доз туберкулина (ППД) для млекопитающих и КАМ результаты симультанной пробы можно учесть, определив местоположение относительно диагонали графика среднего арифметического значения диаметров реакции ГЗТ на обе дозы аллергенов. В случае, если результаты реакций ГЗТ на обе дозы аллергенов располагаются ближе к оси показателей уровня ГЗТ на туберкулин (ППД) для млекопитающих, делается вывод, что животное сенсибилизировано микобактериями бычьего вида. Если значения реакций на высокую и низкую дозы аллергенов располагаются ближе к оси показателей уровня ГЗТ на КАМ, морских свинок считают сенсибилизированными атипичными микобактериями. В сомнительных случаях результаты пробы оценивают по расположению среднего значения диаметров реакций на высокие и низкие дозы аллергенов относительно диагонали графика. При равных значениях диаметров реакций на предлагаемые дозы аллергенов можно делать вывод о сенсибилизации конкретного животного атипичными микобактериями.
Для подтверждения данного заключения на двух группах морских свинок был проведён эксперимент по постановке симультанной пробы с использованием КАМ, туберкулина (ППД) для птиц и туберкулина (ППД) для млекопитающих. Животных первой группы (n = 10) сенсибилизировали M. avium, животных второй группы (n = 10) сенсибилизировали M. bovis. Морским свинкам внутрикожно вводили по 1 и по 5 мкг каждого из аллергенов. Результаты представлены на рисунках 3 и 4.
Как видно из рисунка 3, симультанная проба с использованием КАМ и туберкулина (ППД) для млекопитающих ни в одном из случаев не выявила сомнительных реакций и позволила дифференцировать 10 свинок, сенсибилизированных M. avium, и 10 свинок, сенсибилизированных M. bovis.
В то же время в симультанной пробе с применением туберкулина (ППД) для птиц и туберкулина (ППД) для млекопитающих у животных, сенсибилизированных M. bovis, установлено до 20 % сомнительных реакций, что указывает на низкую специфичность туберкулина (ППД) для птиц по сравнению с КАМ (рис. 4). Тем не менее, оценка симультанной пробы по среднему арифметическому значению диаметров реакции ГЗТ на введение двух доз аллергенов и в этом случае позволила определить вид сенсибилизирующего микроорганизма: средние значения диаметров реакций у морских свинок № 1, 6, 8, 9 оказались правее диагонали, что подтвердило сенсибилизацию животных M. bovis.
Выводы. Дозы туберкулина (ППД) для млекопитающих и КАМ, равные по содержанию белка, исключают возникновение сомнительных реакций при постановке симультанной пробы у морских свинок, сенсибилизированных M. bovis.
Предложен вариант постановки симультанной пробы с использованием двух доз каждого из сравниваемых аллергенов, позволяющий статистически оценить различия в активности микобактериальных аллергенов у конкретного животного, и, таким образом, дифференцировать вид микобактерий, вызвавших сенсибилизацию.
Авторы выражают благодарность Заслуженному ветеринарному врачу РФ, д.в.н. Александру Николаевичу Шарову за помощь, оказанную при подготовке этой статьи.
Литература
1 Наставление по диагностике туберкулёза животных. Утверждено 18 ноября 2002 года.
2 Фрадкин В.А. Диагностические и лечебные аллергены.– М.: Медицина, 1990. – 256 с.
3 Council Directive 97/12/EC of 17 March 1997 amending and updating Directive 64/432/EEC on health problems affecting intra-Community trade in bovine animals and swine.
4 OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. – Paris, 2010.
