ПЦР при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота
Али Найманов
Али Хусинович Найманов, д.в.н., профессор, заведующий лабораторией микобактериозов ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» (ВИЭВ)
Марина Станиславовна Калмыкова, к.в.н., доцент кафедры радиобиологии и вирусологии им. академиков А.Д. Белова и В.Н. Сюрина ФГБОУ ВПО МГАВМиБ
Елена Петровна Вангели, к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории микобактериозов ВИЭВ
Нина Гавриловна Толстенко, к.в.н., ведущий научный сотрудник лаборатории микобактериозов
Анализ литературных данных и проведенных собственных исследований показывает, что при применении ПЦР при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота разными исследователями были получены неоднозначные результаты. Поэтому до настоящего времени единого мнения о диагностической значимости ПЦР не имеется, и этот метод не нашел широкого применения в ветеринарной практике нашей страны и за рубежом более чем за 30-летний период изучения.
В соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулеза животных» от 2002 г., ПЦР применяют при постановке диагноза на туберкулез у крупного рогатого скота в случаях, когда отсутствуют видимые изменения или возникают затруднения при определении характера патологоанатомических изменений. Также применяют и для определения видовой принадлежности выделенных микобактерий. Положительный результат ПЦР свидетельствует о наличии в организме исследованного животного ДНК определенного вида возбудителя туберкулеза. Отрицательный результат указывает на отсутствие ДНК возбудителя туберкулеза в исследуемых образцах биоматериала от животных или выделенной культуры.
В соответствии с 24-ым изданием «Кодекса здоровья наземных животных МЭБ» от 2015 г., при туберкулезе крупного рогатого скота рекомендуемым тестом является внутрикожная туберкулиновая проба, т.е. ПЦР-метод не включен в число рекомендуемых и даже альтернативных тестов при диагностике микобактериальных инфекций КРС.
Тем не менее, ПЦР считается наиболее современным диагностическим тестом, позволяющим выявлять даже единичные клетки возбудителя многих инфекционных заболеваний, за счет многократного увеличения количества копий тестируемых специфических последовательностей ДНК. Тест-системы, основанные на принципе амплификации ДНК, позволяют обнаружить патогенные бактерии и вирусы даже в тех случаях, когда другими способами (иммунологическим, бактериологическим, микроскопическим) их выявление невозможно. Это преимущество достигается за счет высокой чувствительности ПЦР-системы, которая составляет около десяти бактериальных клеток, в то время как чувствительность иммунологических и бактериологических тестов колеблется в пределах 103-106 клеток. Тест-системы ПЦР эффективны при диагностике труднокультивируемых, не ультивируемых и персистирующих форм бактерий. ПЦР-диагностикумы позволяют избегать сложности, связанной с неспособностью таких бактерий размножаться в лабораторных условиях.
К недостаткам, ограничивающим применение ПЦР при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота, многие авторы относят выявление ложноположительных и ложноотрицательных результатов, неспособность ПЦР дифференцировать жизнеспособных микобактерий от нежизнеспособных.
Кроме того, следует учитывать и тот факт, что при ПЦР-диагностике размножению подвергается не микобактерия, а только ее ДНК, причем даже не вся молекула, а только определенный фрагмент, являющийся маркером данного возбудителя.
А.Х. Найманов и соавт. (2009, 2014) считают, что выделение возбудителя туберкулеза, тем более его ДНК, не может являться основанием для установления диагноза, так как, в соответствии с утвержденными нормативными документами, даже при выделении возбудителя необходимо доказать его патогенность на чувствительных к заражению лабораторных животных (из-за возможного наличия L-форм M. bovis и M. tuberculosis).
Следует отметить, что наличие L-форм микобактерий возбудителей туберкулеза является актуальной проблемой при установлении диагноза в благополучных хозяйствах и, особенно, при проведении оздоровительных мероприятий в неблагополучных по этому заболеванию хозяйствах.
В последние годы многими авторами было доказано, что микобактерии туберкулеза образуют L-формы, которые длительное время могут выживать в организме человека, животных и во внешней среде с сохранением способности реверсии в бактериальную клетку (З.Н. Кочемасова, 1970; И.Р. Дорожкова и соавт., 1984; В.С. Федосеев, 1983;И.Н. Рубцова, 1983; М.М. Гертман, 1988; А.С. Донченко и соавт., 1994, 2004; Е.А. Асташова и соавт., 1990; Н.П. Овдиенко и соавт., 1995; Ю.А. Макаров, 1997; Л.А. Таллер, 2003; Л.В. Галатова и соавт., 2004; Е.Ю. Секин, 2006).
И.А. Бакулов и соавт. (1980), В.П. Урбан (1980), В.С. Федосеев и соавт. (1981), В.Г. Ощепков и соавт. (2009) и др. указывают, что при проведении оздоровительных мероприятий возбудитель туберкулеза подвергается воздействию защитных сил организма хозяина и различных внешних факторов окружающей среды. В результате большинство микобактерий погибает, однако остается много поврежденных, но живых клеток, которые сохраняют способность к проникновению в организм животных и реверсии в исходную патогенную форму.
Известно, что L-формы M. bovis выявляются в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах. Так, Е.Ю. Секин (2006) при исследовании 223 проб из 16 хозяйств с различной эпизоотической ситуацией по туберкулезу из объектов животноводческих помещений выявлял L-формы микобактерий в 53% случаев, т.е. даже чаще, чем в бактериальной форме.
В связи с широким распространением и выявлением L-форм микобактерий в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах возникает естественный вопрос: что делать в хозяйствах (особенно в благополучных), где выделяются L-формы M. bovis? Ведь мы не знаем и не можем знать, когда L-формы M. bovis будут (а может и не будут) реверсировать в бактериальную форму. Вопрос остается открытым. Тем более, что практические ветеринарные лаборатории L-формы не выделяют (т.к. эти микобактерии растут только на специальных питательных средах).
Дж. Уотсон (1978), Б. Альбертс и соавт. (1986) при электронной микроскопии и фотографировании установили, что снаружи бактерии окружены жесткой защитной оболочкой, состоящей из белков, полисахаридов и липидов. За оболочкой находится эластичная клеточная мембрана. Эта мембрана полупроницаемая и определяет, какие молекулы поступают в клетку или выходят из нее. Приблизительно одна пятая часть внутреннего объема клетки занята ДНК (ответственной за передачу генетической информации от одной клетки к другой), а также РНК, белками и малыми молекулами.
Поэтому, с учетом всех указанных противоречий и особенностей диагностики такой сложной болезни, как туберкулез крупного рогатого скота, мы считаем, что выявление только ДНК возбудителя не может быть основанием для установления диагноза. ДНК сохраняется неизменной у всех видов микобактерий, в том числе у «живых», «мертвых» и «раненых» (безоболочечных, измененных, дефективных) форм микобактерий.
В завершении публикации считаем целесообразным привести некоторые выдержки из статьи Б.И. Антонова (2002), которые, по нашему мнению, остаются актуальными и в настоящее время:
«Использование метода ПЦР в ветеринарии некоторые восприняли как панацею, позволяющую получить точный и однозначный ответ во всех случаях. Это глубоко ошибочное мнение возникло еще в 90-х годах прошлого века, когда ряд пропагандистов данного метода ориентировали практику на простоту, точность и безграничные возможности…Ветеринарная лабораторная диагностика инфекционных болезней – это целый комплекс различных методов, позволяющих поставить диагноз, на что иногда требуется значительное время – от нескольких суток до нескольких месяцев. И, несмотря на это, ни один из применяемых методов не может полностью заменить другие. В таком положении в настоящее время оказался и метод ПЦР. Поэтому необходимо четко определить место метода ПЦР в системе диагностики конкретной болезни, ситуаций, при которых целесообразно использовать данный метод и при которых этого делать не стоит; знать особенности данного метода, уметь интерпретировать его результаты и дать обоснованное толкование взаимосвязи ПЦР и других методов диагностики. Без этого невозможно успешное использование … ПЦР».
С учетом всего указанного мы завершаем свою публикацию следующим заключением.
Заключение: на современном этапе борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота диагностика должна быть комплексной, с использованием всех классических методов, а ПЦР-метод может использоваться как дополнительный лабораторный экспресс-метод.
ПЦР целесообразно использовать в целях индикации возбудителей туберкулеза и их дифференциации от других видов нетуберкулезных микобактерий, а также как дополнительный сигнальный экспресс-метод при исследовании биоматериала от убитых с диагностической целью животных.
Литература:
1. Альбертс Б. Молекулярная биология клетки / Б. Альбертс, Д. Брей, Дж. Льюис [и др.] // Издательство «Мир». – Москва. – 1986. – 11.2.7. – 223 с.
2. Антонов Б.И. ПЦР и серологическая диагностика без знака равенства // Медицинский центр «Наследственность» / Н.Новгород. – 2002. – С. 8.
3. Асташова Е.А. Персистенция L-форм микобактерий туберкулеза в организме телят / Е.А. Асташова, А.М. Кадочкин, В.С. Суворов // Бюллетень ВИЭВ. – 1990. — № 73-74. – С. 58-60.
4. Галатова Л.В. Выделяемость L-форм микобактерий из биоматериала и объектов внешней среды в зоне Южного Урала / Л.В. Галатова, А.А. Петров // Ветеринарная патология. – 2004. — № 1-2. – С. 159-161.
5. Гертман М.Н. Биологические свойства L-форм Mycobacterium bovis: автореф. дис. … канд. вет. наук: 16.00.03 / Мария Ивановна Гертман. – Москва, 2004. – 19 с.
6. Найманов А.Х. ПЦР на современном этапе борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота / А.Х. Найманов, М.С. Калмыкова, Е.П. Осипова // Современные проблемы диагностики и профилактики хронических зооантропонозных инфекций. – Омск. – 2009. – С. 133-140.
7. Найманов А.Х. Проблемы диагностики микобактериальных инфекций крупного рогатого скота / А.Х. Найманов, Н.Г. Толстенко, Е.П. Вангели [и др.] // Ветеринария. – 2014. — №6. – С. 3-8.
8. Ощепков В.Г. L-трансформация патогенных и атипичных микобактерий под действием физических и химических факторов / В.Г. Ощепков, Е.Ю. Секин, Л.А. Таллер, А.С. Шевцов // Современные проблемы диагностики и профилактики хронических зооантропонозных инфекций. – Омск. – 2009. – С. 146-155.
9. Секин Е.Ю. L-трансформация микобактерий, свойства и способы культивирования L-форм: автореф. дис. … канд. вет. наук: 16.00.03 / Евгений Юрьевич Секин. – Новосибирск. – 2006. – 18 с.
10. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена / Дж. Уотсон // Издательство «Мир». – Москва. – 1978. – 9.5.6. – 720 с.
