Автор:

Али Найманов

Рубрика:

Актуальные проблемы туберкулеза и паратуберкулеза животных

А. Х. Найманов, д.в.н., профессор, заведующий лабораторией микобактериозов

Г. И. Устинова, к.б.н., заведующая лабораторией биохимии

Н. Г. Толстенко, к.в.н., ведущий научный сотрудник

Е. П. Вангели, к.б.н., ведущий научный сотрудник

О. Д. Кучерук, к.в.н., старший научный сотрудник

ФГБНУ Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ).

РЕЗЮМЕ

Представлены результаты изучения сенсибилизирующих свойств различных видов атипичных микобактерий и близкородственных бактерий Nocardia и Rhodococcus.

Установлено, что на территории РФ от реагирующего с неспецифическими реакциями на туберкулин крупного рогатого скота в большинстве случаев (от 59,2 до 75%) выделяются быстрорастущие атипичные микобактерии 4 группы по классификации Раньона. Из НТМБ 4 группы наибольшими сенсибилизирующими свойствами обладают M. fortuitum и M. smegmatis. Из медленнорастущих микобактерий сенсибилизирующими свойствами обладают M.avium–intracellulare (3 группа) и M.scrofulaceum (2 группа). При заражении морских свинок Nocardia transvalensis и Rhodococcus bronchialis в дозе 1-5 мг в 1 мл физиологического раствора сенсибилизирующие свойства бактерий не установлены.

Указано, что для изготовления комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ) для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин целесообразно использовать M. scrofulaceum (2 группа), M. avium-intracellulare (3 группа), M. fortuitum и M. smegmatis (4 группа).

***

Атипичные микобактерии широко распространены в природе, что обуславливает их вездесущность в окружающей среде и живом организме. Выделение атипичных микобактерий в различных федеральных округах и климатических зонах РФ весьма разнообразно.

Анализ проведенных в ВИЭВ исследований показывает, что при бактериологическом анализе биоматериала от реагировавших на туберкулин животных из благополучных по туберкулезу хозяйств в большинстве случаев выделяются быстрорастущие атипичные микобактерии 4 группы по Раньону. Отчетные данные производственных ветеринарных лабораторий также подтверждают результаты этих исследований. Так, на территории России ветеринарные лаборатории выделяют атипичные микобактерии в следующем соотношении: 1 группа – 2%; 2 группа – 19,7%; 3 группа – 16,8%; 4 группа – 59,5% (А.Х.Найманов, 2004).

Н.С.Боганец (2006) указывает, что в России ветеринарные лаборатории выделяют атипичные микобактерии: 1 группа – 3,9%; 2 группа – 22,3%; 3 группа – 14,7%; 4 группа – 59,2%. Из организма крупного рогатого скота в Сибирском регионе наиболее часто выделяют атипичные микобактерии 4 группы: M.phlei – 12,5%; M.peregrinum – 11,1%; M.smegmatis – 10,1%; M.fortuitum – 8,3%.

М.В.Качкин (2007) в благополучных хозяйствах Новосибирской области выделял атипичные микобактерии, которые распределялись по группам: 1 группа – 3,1%; 2 группа – 15,6%; 3 группа – 12,5% и 4 группа – 65,7%.

Н.И.Прокопьева (2004), М.П.Неустроев и соавт. (2009), Н.А.Обоева (2010) установили, что в Якутии, в условиях Крайнего Севера, у реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота персистируют атипичные микобактерии, близкородственные микроорганизмы Nocardia и Rhodococcus, а также грибы рода Aspergillis. Причем атипичные микобактерии 4 группы выявляются до 75% случаев (из них 60,4% – M.vaccae).

А.С.Донченко и соавт. (2011) считают, что основная причина проявления неспецифических реакций на туберкулин в благополучных хозяйствах – сенсибилизация крупного рогатого скота атипичными микобактериями. В регионе Западной Сибири причиной аллергических реакций являются быстрорастущие атипичные микобактерии 4 группы M.fortuitum и M.smegmatis.

Следует отметить, что, несмотря на достаточное количество публикаций, в настоящее время сложно ответить на вопросы, когда, где, при каких условиях и какие виды микобактерий вызывают сенсибилизацию крупного рогатого скота к туберкулину.

Так, Н.П.Овдиенко и соавт. (1990) указывают, что до настоящего времени не ясны причины, при которых проявляется сенсибилизация скота атипичными микобактериями. Авторы предполагают, что неоднократное поступление значительного количества атипичных микобактерий и изменение физиологического состояния под влиянием неблагоприятных или изменившихся условий содержания способствуют иммунобиологической перестройке и сенсибилизации организма животных.

Кроме того, имеются некоторые проблемы и при изучении оптимальной заражающей дозы атипичных микобактерий при установлении их сенсибилизирующих свойств. Так, в соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулеза животных» от 2002 г., при изучении сенсибилизирующих свойств культуру атипичных микобактерий вводят подкожно 2 морским свинкам в дозе 1 мг/мл.

Т.В.Оттен, А.В.Васильев (2005) указывают, что патогенные свойства микробов определяются их сенсибилизирующим и токсическим действием на живой организм и, в первую очередь, на нервную и эндокринную системы. Средняя степень вирулентности нетуберкулезных микобактерий получена авторами при заражении лабораторных животных в дозе 10 мг/мл, которая в 10 раз превышает дозу заражения микобактериями туберкулеза (1 мг/мл).

Н.Н.Кошеев и соавт. (2011) считают, что при изучении сенсибилизирующих свойств, введение атипичных микобактерий в дозе 1 мг/мл часто не вызывает ответной реакции у морских свинок и не дает возможности качественно оценить способность сенсибилизировать организм животных. Авторы предлагают дробное трехкратное введение культур атипичных микобактерий в дозе 10-20 мг/мл, с целью повышения их сенсибилизирующих свойств.

Анализ представленного обзора литературы показывает, что на территории РФ в основном (59,5-75%) выделяют быстрорастущие атипичные микобактерии 4 группы. Данные о сенсибилизирующей роли различных видов микобактерий этой группы весьма противоречивы. Из числа атипичных микобактерий 1-3 группы, по данным большинства исследователей, наиболее часто вызывают сенсибилизацию крупного рогатого скота к туберкулину медленнорастущие микобактерии 3 группы M.avium–intracellulare.

Поэтому, учитывая широкое распространение быстрорастущих нетуберкулезных микобактерий, недостаточную изученность и противоречивые данные о сенсибилизирующих свойствах различных видов микобактерий и близкородственных им бактерий, мы провели исследования по изучению свойств этих микроорганизмов с целью уточнения оптимальной заражающей дозы и выявления отдельных видов, обладающих наибольшими сенсибилизирующими свойствами.

Материалы и методы

Исследования по изучению сенсибилизирующей роли атипичных микобактерий, а также близкородственных бактерий Nocardia и Rhodococcus провели в Вышневолоцком отделе ВИЭВ (о. Лисий) на морских свинках в блок-лаборатории № 3. Предварительно всех отобранных особей исследовали внутрикожной пробой с ППД для млекопитающих в дозе 5 МЕ (25 ТЕ) в 0,1 мл физиологического раствора. В качестве подопытных брали только морских свинок, не реагировавших на внутрикожное введение туберкулина. Из отобранных животных сформировали 11 групп по три морских свинки. Исследования проводили в три этапа. Всего было использовано 99 морских свинок.

На первом этапе морских свинок заражали M.fortuitum, M.smegmatis, M.chelonei, M.vaccae, M.phlei, M.flavescens, M.peregrinum, M.intracellulare, M.scrofulaceum, N.transvalensis и R.bronchialis (с 1988 г. род Gordona, типовой вид Gordona bronchialis) в дозе 1 мг влажной бакмассы культуры микроорганизма в 1 мл физиологического раствора.

На втором этапе новую группу морских свинок заражали этими же культурами микроорганизмов в дозе 1 мг культуры в 1 мл растворителя в смеси с неполным адъювантом Фрейнда.

На третьем этапе очередную группу морских свинок заражали культурами микроорганизмов в дозе 5 мг культуры в 1 мл физиологического раствора.

Через 21-30 дней после заражения морских свинок исследовали симультанной пробой с ППД туберкулином для млекопитающих в дозе 5 МЕ (25 ТЕ) и КАМ в дозе 10 ЕД, в объеме 0,1 мл физиологического раствора внутрикожно с левой и правой стороны в депилированные участки кожи на боках животных. Учет аллергических реакций проводили через 24-48 часов. За положительную реакцию принимали гиперемию кожи и образование припухлости диаметром 5 мм и более в месте введения аллергенов.

Результаты исследований

На первом этапе при исследовании морских свинок, зараженных культурами микроорганизмов в дозе 1 мг в 1 мл физиологического раствора, реагирующих животных не выявили, то есть, сенсибилизирующих свойств микобактерий, а также нокардий (N.transvalensis) и родококков (R.bronchialis) не установили.

На втором этапе при заражении морских свинок культурами микобактерий в дозе 1 мг в 1 мл в смеси с неполным адъювантом Фрейнда наибольшие сенсибилизирующие свойства выявлены у животных, зараженных M. intracellulare (3 группа) и M.scrofulaceum (2 группа).

Следует отметить, что из шести зараженных M.intracellulare и M.scrofulaceum морских свинок пять реагировали на КАМ с образованием припухлости диаметром 18-24 мм, и только две морские свинки реагировали на ППД для млекопитающих с образованием припухлости 8-10 мм. Установленный факт, что животные реагировали в основном на КАМ, мы объясняем тем, что КАМ изготавливают из двух культур атипичных микобактерий: M. intracellulare и M.scrofulaceum. То есть, наиболее интенсивные аллергические реакции выявляются на гомологичные аллергены.

Наибольшее проявление интенсивности аллергических реакций установлено при учете через 24 часа после внутрикожного введения аллергенов.

Морские свинки, зараженные M.fortuitum, M.smegmatis, M.chelonei, M.vaccae и M.flavescens (4 группа), реагировали на КАМ, но не реагировали на ППД туберкулин для млекопитающих, то есть, проявляли слабую степень сенсибилизации.

Особи, зараженные нокардиями, родококками, M.phlei и M.peregrinum (4 грурра), не реагировали на внутрикожное введение ППД для млекопитающих и КАМ, то есть не проявляли признаков сенсибилизации.

Результаты исследования на третьем этапе заражения морских свинок представлены в таблице.   

Результаты изучения сенсибилизирующих свойств различных видов бактерий в дозе 5 мг в 1 мл физиологического раствора

 

№ п/п	Культуры бактерий	морские свинки	Реакция в мм через 24 ч.		Реакция в мм через 48 ч.
			ППД для млекопитающ.	КАМ	ППД для млекопитающ.	КАМ
1	M.fortuitum (4 гр.)	1 2 3	― 5 7	8 9 10	― 5 7	7 8 9
2	M.smegmatis (4 гр.)	1 2 3	5 6 ―	9 7 ―	5 6 ―	8 8 ―
3	M.chelonei (4 гр.)	1 2 3	7 ― ―	10 ― 8	7 ― ―	9 ― 8
4	M.vaccae (4 гр.)	1 2 3	― ― 5	― ― 7	― ― ―	― ― 6
5	M.phlei (4 гр.)	1 2 3	― ― ―	― ― ―	― ― ―	― ― ―
6	M.flavescens (4 гр.)	1 2 3	― ― ―	7 ― 10	― ― ―	7 ― 11
7	M.peregrinum (4 гр.)	1 2 3	― ― ―	― ― 7	― ― ―	― ― ―
8	M. intracellulare (3 гр.)	1 2 3	6 7 8	10 12 15	6 6 8	9 10 14
9	M.scrofulaceum (2 гр.)	1 2 3	― 8 6	― 12 14	― 7 6	― 13 12
10	N.transvalensis	1 2 3	― ― ―	― ― ―	― ― ―	― ― ―
11	R.bronchialis	1 2 3	― ― ―	― ― ―	― ― ―	― ― ―

 

Данные таблицы показывают, что при заражении морских свинок культурами микобактерий в дозе 5 мг в 1 мл физиологического раствора большое количество реагирующих животных выявлено при введение в организм M. intracellulare (3 группа), M.scrofulaceum (2 группа), M.fortuitum, M.smegmatis, M.chelonei и M.flavescens (4 группа). Причем морские свинки реагировали на КАМ и на ППД для млекопитающих (кроме зараженных M.flavescens и M.peregrinum, которые реагировали только на КАМ).

Морские свинки, зараженные нокардиями, родококками и M.phlei, не реагировали на внутрикожное введение КАМ и ППД для млекопитающих.

Проведенные нами исследования показывают, что при увеличении дозы заражения культурами микобактерий до 5 мг в 1 мл достигается определенный уровень сенсибилизации у морских свинок. Тем не менее, на эту дозу не реагировали животные, зараженные N.transvalensis, R.bronchialis и M.phlei. По-видимому, нижним порогом заражающей и вызывающей сенсибилизацию дозы атипичных микобактерий является доза 5 мг культуры в 1 мл физиологического раствора.

Кроме того, ранее проведенными исследованиями было установлено, что более яркая сенсибилизация выявляется при дробном заражении морских свинок (через 2 недели – повторное заражение в дозе 5 мг культуры).

Выводы

1. В благополучных по туберкулезу хозяйствах РФ от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота и различных объектов внешней среды в 59,2-75% случаев выделяются быстрорастущие атипичные микобактерии 4 группы по классификации Раньона.

2. Из медленнорастущих атипичных микобактерий значительными сенсибилизирующими свойствами обладают M.intracellulare (3 группа) и M.scrofulaceum (2 группа). Из быстрорастущих микобактерий 4 группы наибольшими сенсибилизирующими свойствами обладают M.fortuitum и M.smegmatis.

3. При изучении сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий на морских свинках минимальная заражающая доза должна быть не менее 5 мг влажной бакмассы культуры микобактерий. Для получения более достоверных результатов целесообразно повторное заражение через 14 дней в дозе 5 мг в 1 мл физиологического раствора.

Заключение

В целях дифференциации неспецифических реакций на туберкулин на территории РФ необходимо использовать комплексный аллерген из атипичных микобактерий (КАМ), изготовленный из M.scrofulaceum (2 группа), M.intracellulare (3 группа), M.fortuitum и M.smegmatis (4 группа).

Литература

1. Донченко А.С. Диагностика туберкулеза животных / А.С.Донченко, В.Н.Кисленко, Н.А.Донченко [и др.]  – Новосибирск, 2011. – 246 с.

2. Качкин М.В.  Комплексная оценка проявления туберкулиновых реакций у животных на территориальном и популяционном уровне с использованием информационных технологий: автореф. дис. … канд. вет. наук. – Новосибирск, 2007. – 22 с. 

3. Кошеев Н.Н. Новый способ определения сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий / Н.Н.Кошеев, В.Ф.Бордюг, В.Г.Ощепков [и др.] // Инфекционная патология животных. – Омск, 2011. – С.102 – 105.

4. Найманов А.Х. Проблемы диагностики и профилактики туберкулеза крупного рогатого скота в современных условиях / Ветеринарная патология. – 2004. – № 1 – 2 (9). – С. 18 – 23.

5. Неустроев М.П. Мониторинг эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота в республике Саха (Якутия) / М.П.Неустроев, Н.И.Прокопьева, Г.П.Протодьякова // Сб. науч. трудов ВНИИБТЖ. – 2009. – С. 140 – 143.

6. Оттен Т.Ф. Микобактериоз / Т.Ф.Оттен, А.В.Васильев. – Санкт-Петербург, 2005. – 218 с.

7. Овдиенко Н.П. Видовая принадлежность микобактерий, выделяемых от крупного рогатого скота и из объектов внешней среды / Н.П.Овдиенко, В.И.Косенко, А.Х.Найманов [и др.] // Проблемы туберкулеза. – 1990. – № 1. – С. 46 – 48.

8. Прокопьева Н.И. Особенности контроля эпизоотического процесса туберкулеза крупного рогатого скота в экстремальных условиях Якутии: автореф. дис. … д-ра вет. наук. – Новосибирск, 2004. – 35 с.

• туберкулез
• микобактерии
• атипичные микобактерии
• нокардии
• родококки
• сенсибилизация
• морские свинки
• ППД туберкулин для млекопитающих
• КАМ