Проблемы диагностики микобактериальных инфекций крупного рогатого скота
Али Найманов
Али Хусинович Найманов, д.в.н., профессор, заведующий лабораторией микобактериозов
Нина Гавриловна Толстенко, к.в.н., ведущий научный сотрудник
Елена Петровна Вангели, к.б.н., ведущий научный сотрудник
Галина Ивановна Устинова, к.б.н., заведующая лабораторией биохимии
Михаил Иванович Гулюкин, академик РАСХН, директор ВИЭВ
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, gulukin@viev.ru
Представлено современное состояние диагностики туберкулеза и паратуберкулеза крупного рогатого скота. Указаны основные достоинства и недостатки, а также новые пути совершенствования диагностики хронических микобактериальных инфекций.
Туберкулез
Туберкулез является одной из древнейших, широко распространенных и сложных инфекционных заболеваний человека и животных, при котором до настоящего времени не разработаны высокоэффективные средства иммунной защиты и лечения. Поэтому основой профилактических и оздоровительных мероприятий остается диагностика болезни.
На современном этапе борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота, основным методом диагностики является аллергический метод с применением внутрикожной пробы с ППД-туберкулином для млекопитающих. Следует отметить, что при диагностике туберкулеза нет ни одного идеального метода. Применение внутрикожной туберкулиновой пробы также имеет две главные и противоположные проблемы: первая проблема – это перевыявление реагирующих животных с «неспецифическими» реакциями на туберкулин в благополучных хозяйствах; вторая проблема – недовыявление зараженных туберкулезом животных в неблагополучных хозяйствах.
Поэтому при проведении исследований на туберкулез в благополучных хозяйствах необходимо повысить специфичность, а в неблагополучных – чувствительность диагностических исследований. Задачи эти не совсем простые, так как при повышении чувствительности внутрикожной туберкулиновой пробы (увеличением дозы, кратности введения туберкулина, изменением критериев оценки аллергических реакций и т.д.) одновременно снижается специфичность, и, наоборот, при увеличении специфичности – снижается чувствительность туберкулиновой пробы.
В целях совершенствования аллергической диагностики туберкулеза можно подобрать наиболее чувствительные и удобные места для введения туберкулина, определить оптимальную дозу, совершенствовать методы введения, подобрать оптимальные критерии оценки аллергических реакций, т.е. можно оптимизировать и стандартизировать аллергическую диагностику туберкулеза для отдельных животных.
Однако, учитывая массовость и масштабность проведения диагностических исследований на туберкулез, невозможно отстандартизировать организмы всех исследуемых животных по чувствительности и специфичности к этим исследованиям. И вряд ли это возможно, так как в разных регионах нашей большой страны, в разных хозяйствах с различной эпизоотической ситуацией по туберкулезу имеются животные с различным проявлением микобактериальной инфекции [7].
По этой причине прижизненная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота одной внутрикожной туберкулиновой пробой не может быть единственным и идеальным диагностическим средством. Диагностика должна быть комплексной, с применением внутрикожной туберкулиновой пробы и других дополнительных методов диагностики.
Поэтому на современном этапе борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота в какой-то мере решить указанные проблемы можно разным подходом к диагностике заболевания в различных хозяйствах методом подбора для каждой категории хозяйств разного комплекса диагностических исследований.
В связи с указанным, в последние годы ВИЭВ совместно с ВНИИБТЖ, ИЭВСиДВ, ВГНКИ, Прикаспийский ЗНИВИ и ФЦТРБ ВНИВИ разработали новые «Правила о мероприятиях по борьбе с туберкулезом животных».
В проекте этих правил все хозяйства условно разделены на пять категорий: благополучные хозяйства, благополучные хозяйства, где выделяются реагирующие животные с неспецифическими реакциями (или условно благополучные хозяйства), неблагополучные по туберкулезу хозяйства, неблагополучные хозяйства со смешанной микобактериальной инфекцией и индивидуальные хозяйства.
В этих пяти категориях хозяйств, с учетом особенностей диагностики туберкулеза и целей проводимых исследований, предлагается специальный комплекс диагностических исследований для каждой категории хозяйств.
В конце проекта новых правил впервые внесена графа «Ветсанэкспертиза мяса и мясных продуктов при туберкулезе животных».
Проект новых правил представлен для утверждения в департамент ветеринарии и животноводства МСХ Российской Федерации.
Ретроспективный анализ эпизоотической ситуации показывает, что широкомасштабные мероприятия по борьбе с туберкулезом крупного рогатого скота стали проводить на территории нашей страны с 1951 года – после выяснения эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота во всех хозяйствах. Так, по состоянию на 1 января 1951 года было зарегистрировано 9833 неблагополучных пункта (н.п.), заболело 86894 голов крупного рогатого скота. В 1987 году было 1945 н.п., заболело 340655. На 1 января 2012 года оставалось 10 н.п., заболело туберкулезом 1631 голова КРС. Однако по состоянию на 1 января 2013 года в РФ впервые за последние 25 лет увеличилось количество н.п. и заболевших животных. Так, на 01 января 2013 года стало 11 н.п., заболело туберкулезом в 2012 году 2594 голов скота (т.е. на 963 голов больше, чем в 2011 году).
Анализ эпизоотической ситуации показывает, что по мере сокращения количества неблагополучных пунктов и заболевших туберкулезом животных, т.е. улучшения эпизоотической ситуации, увеличивается выявление неспецифических реакций в благополучных хозяйствах.
Так, за 2001 – 2012 годы было выявлено всего реагирующих – 735 786 голов, из них в благополучных хозяйствах – 665 838 (90,4%), а в неблагополучных хозяйствах – 70 948 (9,6%), т.е. в благополучных хозяйствах выявляется более 90% реагирующих животных [2].
В последние годы в стране сложилась такая ситуация, когда количество реагирующих животных в благополучных хозяйствах в девять раз превышает число реагирующих в неблагополучных. В практических условиях, опасаясь пропустить туберкулез, во многих благополучных хозяйствах всех реагирующих особей сдают на убой и, как следствие этого, несут значительный экономический ущерб. А в некоторых хозяйствах под видом «неспецифических реакций» содержатся больные туберкулезом животные, которых в лучшем случае сдают на убой без объявления неблагополучия хозяйства. Поэтому трудность выявления неспецифических реакций и дифференциации этих реакций в каждом отдельном хозяйстве стала самой актуальной проблемой при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота.
Со времени возникновения проблемы неспецифических реакций были предложены различные методы их дифференциации, однако наибольшее признание и распространение во всем мире получил метод симультанной туберкулиновой пробы.
Симультанная проба заключается в одновременном введении животным двух аллергенов: туберкулина для млекопитающих и препарата из других видов микобактерий (не относящихся к возбудителям туберкулеза бычьего и человеческого видов). При учете результатов симультанной пробы заключение о виде сенсибилизирующего агента делают по разнице проявления ответной реакции на эти аллергены.
В историческом плане известно, что впервые симультанную пробу с использованием туберкулина для млекопитающих и туберкулина для птиц предложил в 1925 году N.Plum в Дании.
Следует отметить, что в начальный период разработки и применения симультанной пробы в нашей стране также использовали туберкулин для млекопитающих и туберкулин для птиц. Использование в симультанной пробе туберкулина для птиц было вполне оправдано, так как в этот период наиболее частым сенсибилизирующим агентом для крупного рогатого скота являлись микобактерии туберкулеза птичьего вида, имевшие в те времена практически повсеместное распространение. В дальнейшем, после оздоровления птицеводческих хозяйств от туберкулеза птиц, наиболее частыми сенсибилизирующими агентами стали уже другие виды атипичных микобактерий и представители микобактерий комплекса avium-intracellulare.
При применении симультанной пробы одновременно с туберкулином для млекопитающих может использоваться любой аллерген из любых видов микобактерий, отличающихся от микобактерий туберкулеза. Однако, в связи с тем, что в любой местности микобактериальный фон может изменяться в зависимости от перемещений скота, кормов, подстилочных, строительных и других материалов, была доказана нецелесообразность изготовления и применения аллергенов из местных культур микобактерий для каждой зоны страны.
Поэтому для практического применения симультанной пробы наиболее оптимальным считается использование аллергена, изготовленного из смеси различных микобактерий, являющихся наиболее частой причиной сенсибилизации крупного рогатого скота в различных зонах страны.
В настоящее время в зарубежных странах для дифференциации неспецифических реакций применяют симультанную туберкулиновую пробу с ППД-туберкулином для млекопитающих и ППД-туберкулином для птиц. В нашей стране, в соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулеза животных» от 2002 года, для дифференциации неспецифических реакций применяют симультанную пробу с ППД-туберкулином для млекопитающих и КАМ, а также симультанную пробу с ППД-туберкулином для млекопитающих и ППД-туберкулином для птиц.
В связи с тем, что в последние годы в благополучных хозяйствах Российской Федерации в основном устанавливают сенсибилизацию крупного рогатого скота атипичными микобактериями, а сенсибилизация M.avium выявляется относительно редко, считается, что для дифференциации неспецифических реакций более предпочтительно применять симультанную пробу с ППД-туберкулином для млекопитающих и КАМ. Недостатком этого метода является недостаточная эффективность. Так, по сообщениям разных авторов из разных регионов применение симультанной пробы с ППД-туберкулином для млекопитающих и КАМ позволяет дифференцировать неспецифические реакции от 0 до 77% случаях. Кроме того, в соответствии с наставлением, симультанная проба с ППД для млекопитающих и КАМ «является групповой и дает возможность ориентироваться в ситуации по туберкулезу лишь в целом по стаду или по группе (не менее шести голов) исследуемых животных».
Поэтому на современном этапе борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота в России дальнейшее совершенствование КАМ и методики его применения является самой актуальной проблемой при диагностике туберкулеза КРС.
В связи с актуальностью проблемы неспецифических реакций в ВИЭВ разработан новый комплексный аллерген из атипичных микобактерий (КАМ-2). В состав КАМ-2 (ВИЭВ) включены наиболее часто выделяемые от реагирующих животных и обладающие сенсибилизирующими свойствами атипичные микобактерии. Разработано новое наставление по применению симультанной пробы с ППД-туберкулином для млекопитающих и КАМ-2 с групповым и индивидуальным учетом аллергических реакций.
Паратуберкулез
Паратуберкулез, паратуберкулезный энтерит, болезнь Йоне – хроническая инфекционная болезнь, в основном, жвачных животных, чаще всего протекающая латентно, характеризующееся поражением кишечника и мезентериальных лимфатических узлов и как следствие – сопровождающаяся расстройством желудочно-кишечного тракта (диареей) с прогрессирующим истощением – до летального исхода.
Паратуберкулез крупного рогатого скота впервые был описан A. Johne и L. Frothingham в 1895 году как особая форма туберкулеза кишок, вызываемая ослабленным возбудителем бычьего или птичьего вида туберкулеза. В 1912 году T.W. Twort, Y.Z. Ingram [21] из подвздошной кишки больной коровы на искусственных питательных средах выделили возбудителя и назвали его Mycobacterium enteritidis chronicae bovis. В дальнейшем, после исследования возбудителя как отдельного вида рода микобактерий, возбудитель заболевания был квалифицирован как Mycobacterium paratuberculosis, а болезнь названа паратуберкулезом. После исследований с применением молекулярно-генетических методов было доказано, что гены M. avium и M. paratuberculosis на 99% гомологичны. Впоследствии, по предложению M.F. Thorel et al. (1990) [19], возбудитель паратуберкулеза стали считать подвидом микобактерий птичьего вида – Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP).
Паратуберкулез крупного рогатого скота регистрируется почти во всех странах мира. По данным МЭБ за 2001–2006 годы паратуберкулез крупного рогатого скота был регистрирован в 61 стране, на всех континентах земного шара [12]. По данным ООН, паратуберкулез признан одной из самых серьезных болезней современности со значительными экономическими последствиями. Экономический ущерб возникает из-за снижения производства продукции животноводства, потери молочной продуктивности, бесплодия, истощения, выбраковки или гибели больных паратуберкулезом особей.
По данным Y. Benedictus et al. (1987) [14], экономический ущерб от убоя каждой клинически больной коровы от недополучения молока на 19,5 % и снижения в нем жира и белка на 20% составляет 279 фунтов стерлингов, а убыток от убоя коров, не имеющих клинических признаков паратуберкулеза, состоит в снижении надоя молока на 16% и уменьшения содержания в нем жира и белка на 17,5%. В случаях задержки убоя больных коров на год, размер убытков увеличивается еще на 5-6%.
Кроме того, следует учитывать, что при убое клинически больных паратуберкулезом коров потери более значительны, чем при многих других инфекциях, когда полностью используется туша больного животного. От клинически больного паратуберкулезом животного туша бракуется и идет на утилизацию из-за атрофии мышц.
В настоящее время паратуберкулез остается одной из недостаточно изученных, сложно контролируемых и диагностируемых инфекций. Инкубационный период может длиться от 6 месяцев до 15 лет, а может быть и самоизлечение, т.е. клиника может не проявиться за весь период жизни животного. При этом инфицированные особи, не проявляя клинических признаков болезни, являются носителями микобактерий и периодически выделяют возбудитель во внешнюю среду, что создает условия для заражения восприимчивых здоровых животных и как следствие этого – распространению паратуберкулеза в стаде.
Поэтому некоторые авторы сравнивают проблему паратуберкулеза с верхушкой айсберга (айсберг-эффект), когда на один клинический случай приходятся десятки случаев инфицированных животных в латентной форме.
Кроме того, в последние десятилетия ведутся острые дискуссии о причастности возбудителя паратуберкулеза животных в возникновении болезни Крона у человека. При болезни Крона, как и при паратуберкулезе животных, у человека поражается желудочно-кишечный тракт, специальное лечение отсутствует. Болезнь характеризуется периодическими эпизодами рецидивов, ремиссий и требует нескольких хирургических вмешательств на протяжении всей жизни [16, 17, 20].
Европейская комиссия здравоохранения и научный комитет по охране здоровья животных в 2000 году рассматривали связи между этими заболеваниями, но не пришли к единому мнению. Не было, однако, исключено предположение, что возбудителем заболевания у животных и человека является M. paratuberculosis. Проходивший в США в 2009 году 10-й международный симпозиум по паратуберкулезу также не дал конкретный ответ на этот вопрос. Тем не менее, в связи с широким распространением инфекции, а также беспокойства, вызванного возможной причастностью M. paratuberculosis в возникновении болезни Крона у человека, в некоторых странах Австралии, Норвегии, Исландии, Японии, Нидерландах и США созданы национальные программы по контролю, искоренению и профилактике паратуберкулеза [3].
В Российской Федерации паратуберкулез крупного рогатого скота регистрируется в единичных случаях. Так, по официальным статистическим данным в 2008 году было зарегистрировано четыре неблагополучных пункта (н.п.), в 2009 году – пять н.п., в 2010 году – шесть н.п., в 2011 году – четыре н.п., в 2012 году – три н.п., в 2013 году – пять н.п.
Ретроспективный анализ эпизоотической ситуации показывает, что в СССР и РФ никогда не было широкого распространения паратуберкулеза крупного рогатого скота и не было неблагополучных пунктов, где паратуберкулез в «клинической форме» выявлялся у значительного числа животных.
Многолетний опыт работы сотрудников лаборатории микобактериозов ВИЭВ дает основание предполагать, что и в дальнейшем, при условии соблюдения положений утвержденных нормативных документов, паратуберкулез крупного рогатого скота не получит широкого распространения. Тем более, что по технологии содержания высокопродуктивных животных не содержат старых, больных и низкопродуктивных особей. Так, в хороших хозяйствах проводят ежегодную выбраковку до 30% поголовья крупного рогатого скота, т.е. за три-четыре года полностью обновляются стада.
Тем не менее, необходимо учитывать, что и на современном этапе борьбы с паратуберкулезом нигде в мире нет достаточно эффективных средств диагностики (в соответствии с 21 изданием «Кодекса здоровья наземных животных МЭБ» от 2012 года – при паратуберкулезе нет рекомендуемых тестов, а в качестве альтернативных тестов предлагается внутрикожная туберкулиновая проба и иммуноферментный анализ) [5].
В «скрытости» инфекции, низкой чувствительности и специфичности прижизненных методов диагностики, сложности выделения, культивирования и идентификации возбудителя заболевания лабораторными методами, а также в отсутствии возможности воспроизведения паратуберкулеза на лабораторных животных и заключаются основные причины сложности в установлении диагноза по этому заболеванию.
Так, возбудитель паратуберкулеза культивируется на специальных питательных средах с добавлением фактора роста – микобактина, растет очень медленно, первичный рост появляется через 8-12 недель [1, 10].
При микроскопии микобактерии всех видов окрашиваются одинаково, поэтому микобактерии паратуберкулеза невозможно отличить от множества других видов микобактерий [1].
При выделении и необходимости идентификации вида возбудителя туберкулеза (бычий, человеческий или птичий) можно использовать биопробу на морских свинках, кроликах и курах. При паратуберкулезе биопроба не применяется, т.к. возбудитель не патогенен для лабораторных животных.
Кроме того, в последние годы на диагностику паратуберкулеза все чаще влияет так называемый «человеческий фактор». В настоящее время в нашей стране осталось очень мало ветеринарных специалистов, которые видели паратуберкулез или работали с этой болезнью. Часто при патологоанатомическом осмотр подозреваемых в заболевании убитых коров нормальную складчатость кишечника принимают за паратуберкулезные изменения. Следует иметь в виду, что поперечная или продольная складчатость слизистой оболочки кишечника наблюдается у здоровых животных вследствие предсмертных сокращений поперечных и продольных мышц кишечника, а так как в подвздошной кишке эти мышцы наиболее сильные, то складчатость в этом отрезке кишечника проявляется наиболее выраженно [9, 11]. Кроме того, при паратуберкулезе утолщается и становится складчатой не только слизистая, но и стенки кишечника, в итоге стенки кишечника так утолщаются, что пораженный участок напоминает плотную резиновую трубку с узким просветом.
С учетом указанного, изучение возможности применения новых, более современных методов в целях совершенствования диагностики паратуберкулеза было и остается актуальной проблемой.
В последние годы появились сообщения о возможности применения ПЦР при диагностике паратуберкулеза крупного рогатого скота [4, 8, 13, 15, 18, 22]. Метод ПЦР, как правило, используют для идентификации культур микобактерий, выделенных на питательных средах, а также для исследования проб фекалий или сывороток крови от подозреваемых в заболевании животных.
Заключение
На современном этапе борьбы с хроническими микобактеиальными инфекциями диагностика должна быть комплексной с применением эпизоотологических, аллергических, серологических, молекулярно-генетических, патологоанатомических и бактериологических методов.
В комплекс методов диагностики паратуберкулеза крупного рогатого скота целесообразно включить ПЦР-анализ для исследования фекалий от подозреваемых в заболевании паратуберкулезом животных и идентификации выделенных культур микобактерий.
В связи с тем, что при этой болезни поражается желудочно-кишечный тракт, а возбудитель болезни в больших количествах выделяется во внешнюю среду вместе с фекалиями, в целях совершенствования прижизненной диагностики паратуберкулеза крупного рогатого скота необходимо использовать ПЦР-анализ для исследования фекалий от подозреваемых в заболевании животных.
Литература
1. Алиев А.И., Фадеева Н.Г. Выделение микобактерий паратуберкулеза из патологического материала // Бюллетень ВИЭВ. 1990. №73-74. С. 71-76.
2. Гулюкин М.И., Найманов А.Х. Обзор эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота в РФ и совершенствование мер борьбы с этой инфекцией // Тезисы докл. Междунар. научно-практ. конф., посвящ. 45-летию Прикаспийской НИВИ. Махачкала. 2012. С. 3-8.
3. Завгородний А.И., Подмогова С.Д., Головко В.А. Паратуберкулез сельскохозяйственных животных // Ветеринарная медицина. 2010. Выпуск 94. С. 171-173.
4. Калмыков В.М. Использование полимеразной цепной реакции в целях мониторинга благополучия по микобактериальным инфекциям зоопарковых, цирковых и сельскохозяйственных животных // Автореферат диссер. на соискание уч. ст. канд. вет. наук. 2013.
5. Кодекс здоровья наземных животных МЭБ. Двадцать первое издание. 2012. Том 1.
6. Наставление по диагностике паратуберкулеза (паратуберкулезного энтерита) животных. Утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 05.04.2001. № 13-5-02/0050.
7. Найманов А.Х. Проблемы диагностики и профилактики туберкулеза крупного рогатого скота в современных условиях // Ветеринарная патология. 2004. № 1-2(9). С. 18-23.
8. Найманов А.Х., Калмыков В.М. ПЦР при диагностике паратуберкулеза крупного рогатого скота // Российский ветеринарный журнал. 2012. № 3. С. 30-32.
9. Нестреляев С.С. Особенности патоморфологического метода диагностики при паратуберкулезе животных // Труды ВИЭВ. 2013. Т. 77. С.125-133.
10. Овдиенко Н.П., Найманов А.Х., Толстенко Н.Г., Якушева О.В., Устинова Г.И., Сидорчук В.А., Альбертян М.П., Суворов В.С. Профилактика и меры борьбы с паратуберкулезом животных // Ветеринария. 2007. №12. С.3-7.
11. Поддубский И.В., Щуревский В.Е., Аликаева А.П. Материалы по изучению паратуберкулеза сельскохозяйственных животных // Труды ВИЭВ. 1962. Т. 26. С. 115-133.
12. Шуляк Б.Ф. 110 лет со дня открытия возбудителя паратуберкулеза // Российский ветеринарный журнал. 2005. № 9. С. 238-239.
13. Alinovi C.A., Ward M.P., Lin Tsang Long, Moore G.E., Wu Ching Ching. Real-time PCR, compared to liquid and solid culture media and Elisa, for detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis // Veterinary Microbiology. 2009. 136 (1/2). P. 177-179.
14. Benedictus Y., Diykhuizen A.A., Stelwagen J. // Vet. Rec., 1987, 121, 7: 142-146.
15. Ellingson J.L.E., Bolin C.A., Stabel J.R. Identification of a gene unigue to Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis and application to diagnosis of paratuberculosis // Mol. Cell. Probes. 1998. 12. 133-142.
16. Hermon-Taylor J. The Causation of Crohn’s Disease and Treatment Autimicrobial Drugs // Ital. J. Yastroenterology-Hepatology – 1998 Dec. – № 30(6). – P. 607-610.
17. Chamberlin W. Mycobacterium avium — Subsp. Paratuberculosis as one cause of Crohn’s disease / Chamberlin W., Yaran D. Y., Hulten K. // Aliment Pharmacol Ther. 2001:15:337-346.
18. Cousins D., Whittington R., Masters A., Evans R., Kluver P. Investigation off alse positives in the is 900 PCR for identification of M. paratuberculosis // Mol. Cell. Probes. 1999. 14. 431-442.
19. Thorel M.F., Krichevsky M., Levy-Frebaut V. Numerical taxonomy of mycobactin-dependent mycobacteria, emended description of M. avium subsp. nov., M. avium subsp. paratuberculosis subsp. nov., and M. avium subsp. silvaticum subsp. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol., 1990. 40. 254-260.
20. Twort T.W., Ingram Y.Z. A method for isolating and cultivation the Mycobacterium enteritis chroncae pseudotuberculosis bovis, Johne and some experiments on the preparation of diagnostic, vaccine for pseudotuberculose enteritis of bovines // Vet. J., 1912, 68, 353-365.
21. Thompson D.E. The Role of Mycobacteria in Crohn’s Disease // J. Med. Microbiol. 1994. № 41. P. 74-94.
22. Vary C.P.H., Anderson P.R., Yreen E., Hermon-Taylor J., McFadden J.J. Use of highly specific DNA probes and the polimerase chain reaction to detect Mycobacterium paratuberculosis in Johne’s disease // J. Clin. Microbiol. 1990. 28. 268-275.
