Разработка лабораторной модели в целях выявления ПЧЗТ при исследовании микобактериальных аллергенов
Али Найманов
Ю. М. Мясоедов, ФКП «Курская биофабрика», начальник ОБТК, кандидат биологических наук, г. Курск, MyasoedovYurij@yandex.ru
А.Х. Найманов, Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко Российской академии сельскохозяйственных наук (ВИЭВ Россельхозакадемии), заведующий лабораторией микобактериозов ВИЭВ, профессор, доктор ветеринарных наук, г. Москва
Резюме
В исследовании показано, что лабораторная модель, предполагающая использование морских свинок, сенсибилизированных микобактериями M.bovis, штамм БЦЖ, является наиболее оптимальной для проведения сравнительных исследований иммунобиологических показателей микобактериальных аллергенов. Предложенная модель по критериям интенсивности развития кожной аллергической реакции и специфичности характеризуется высокой степенью сходства с моделью, предполагающей использование вирулентных микобактерий M.bovis, штамм 8.
Введение
Туберкулёз является одним из древнейших, широко распространённых и сложных инфекционных заболеваний человека и животных. До настоящего времени против туберкулёзной инфекции не разработаны высокоэффективные средства иммунной защиты и лечения. Поэтому основой профилактических и оздоровительных мероприятий была и остаётся диагностика заболевания [5].
На современном этапе борьбы с туберкулёзом животных основным методом диагностики является аллергический, с использованием ППД-туберкулина для млекопитающих и птиц, вводимого внутрикожно.
Применение внутрикожной пробы создаёт две главные и противоположные проблемы. Первая – это перевыявление, то есть, выявление реагирующих здоровых животных с неспецифическими реакциями на туберкулин. Вторая – недовыявление больных туберкулёзом животных в неблагополучных хозяйствах.
Исходя из этого, при проведении аллергических исследований в благополучных хозяйствах необходимо повышать специфичность, а в неблагополучных хозяйствах – чувствительность диагностических исследований.
Анализ эпизоотической ситуации по туберкулёзу крупного рогатого скота в различных животноводческих хозяйствах РФ демонстрирует, что за последние годы по мере постепенного сокращения количества неблагополучных пунктов и числа заболевших туберкулёзом животных, то есть, с улучшением эпизоотической ситуации по туберкулёзу, увеличивается выявление неспецифических реакций на туберкулин. Так, в последние годы в благополучных хозяйствах выявляется в девять раз больше реагирующих животных с неспецифическими реакциями, чем в неблагополучных хозяйствах [4].
Основным методом дифференциации неспецифических реакций является внутрикожная симультанная проба с ППД-туберкулином для млекопитающих, с ППД-туберкулином для птиц и КАМ, соответственно, изготавливаемых из возбудителей туберкулёза M.bovis, M.avium и атипичных микобактерий M.intracellularae и M.scrofulaceum [1]. Основными показателями качества микобактериальных аллергенов являются активность и специфичность, определяемые на сенсибилизированных разными видами микобактерий морских свинках [6].
К настоящему времени известно несколько вариантов лабораторной модели воспроизведения повышенной чувствительности замедленного типа (ПЧЗТ), предполагающие введение морским свинкам инактивированных, вирулентных или авирулентных микобактерий.
Так, в первом случае воспроизводится характерная для туберкулёза ПЧЗТ, без репликации микобактерий и вероятности инфицирования обслуживающего персонала. Во втором случае моделируется классический процесс туберкулёза с репликацией микобактерий и вероятностью инфицирования обслуживающего персонала и животных. В третьем случае моделируется туберкулёзный процесс соответствующий латентной инфекции, характеризующийся низкой интенсивностью репликации микобактерий, при которой развивается ПЧЗТ.
Очевидно, что перечисленные варианты будут характеризоваться различными свойствами, что, в свою очередь, может оказать влияние на результат сравнительных исследований. Поэтому целью нашей работы была разработка лабораторной модели ПЧЗТ, в большей степени сходной с гиперчувствительностью, развивающейся в условиях инфекционного процесса, пригодной для осуществления сравнительных исследований биологических показателей микобактериальных аллергенов.
Материалы и методы
В исследованиях было использовано 42 головы беспородных самок морских свинок массой 500±100 гр., одновременно полученных из ФГБУН НЦБМТ ФМБА России, филиал «Андреевка». Животных содержали в вольерах на стандартном рационе кормления (гранулированный корм). Перед проведением исследований для исключения туберкулёза морских свинок тестировали аллергическим способом с использованием 5 МЕ ППД-туберкулина для млекопитающих [5]. При проведении исследований были использованы следующие варианты микобактериальных суспензий и способы их введения:
M. bovis, штамм №8 (вирулентные) на физиологическом растворе, доза введения 1мг/см3, внутримышечно в заднебедренную группу мышц;
M. bovis, штамм №8 (инактивированные) на вазелиновом масле, доза введения 1мг/см3, внутримышечно в заднебедренную группу мышц;
M. bovis, штамм БЦЖ (авирулентные) на физиологическом растворе, доза введения 0,2 мг/см3, варианты введения описаны в исследованиях.
Учитывая, что при использовании вышеперечисленных моделей допускается варьирование дозировок суспензий (с учётом содержания микобактериальных антигенов) [6], в настоящем исследовании были использованы дозы, подобранные ранее, с учётом минимального значения антигенной нагрузки на организм лабораторных животных, обеспечивающие требуемый уровень развития кожных реакций ПЧЗТ – не менее 8 мм (для минимальных дозировок) и не более 25 мм (для максимальных дозировок) [6].
Оценку развития ПЧЗТ моделей осуществляли с использованием разведений ППД-туберкулина для млекопитающих: 25, 5, 1 МЕ в 0,1 см3 и ППД-туберкулина для птиц: 125 МЕ, 25 МЕ в 0,1 см3 на растворителе микобактериальных аллергенов. Использование данных дозировок ППД-туберкулина для млекопитающих и ППД-туберкулина для птиц обусловлено линейностью: количество вводимого аллергена – величина иммунного ответа.
Статистическую обработку результатов экспериментов проводили общепринятыми методами, рассчитывая среднее арифметическое, ошибку среднего арифметического, стандартное отклонение. Достоверность различия между значениями оценивали по критерию знаков (z), результаты принимались за достоверные при р< 0,05.
Результаты исследования и обсуждения
Первым этапом исследований была сравнительная оценка вариантов лабораторной модели ПЧЗТ с использованием морских свинок, сенсибилизированных вирулентными, инактивированными и авирулентными микобактериями.
В связи с тем, что патогенные микобактерии вызывают классический туберкулёзный процесс, вариант, предполагающий использование живых вирулентных микобактерий, являлся контрольным. Оценка осуществлялась с использованием различных доз ППД-туберкулина для млекопитающих (по интенсивности проявления кожной реакции ПЧЗТ) и ППД-туберкулина для птиц (по интенсивности и частоте проявления кожной реакции ПЧЗТ). При этом использование ППД для млекопитающих позволяет оценить интенсивность развития сенсибилизации, а ППД для птиц – специфичность. Результаты исследования представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Интенсивность (мм) и частота кожной реакции ПЧЗТ на ППД для млекопитающих и ППД для птиц у морских свинок, сенсибилизированных вирулентными, авирулентными и инактивированными микобактериями
|
Морские свинки, сенсибилизированные M.bovis, штамм №8 (вирулентные) |
|||||
|
ППД-туберкулин |
для млекопитающих |
для птиц |
|||
|
Доза туберкулина
|
25 МЕ |
5 МЕ |
125 МЕ |
25 МЕ |
|
|
№ морской свинки
|
1 |
15,5 |
8,0 |
0 |
0 |
|
2 |
10,0 |
9,0 |
8,0 |
0 |
|
|
3 |
14,0 |
10,5 |
0 |
0 |
|
|
4 |
19,0 |
13,5 |
10,0 |
0 |
|
|
5 |
15,0 |
12,0 |
9,0 |
0 |
|
|
6 |
14,0 |
14,5 |
0 |
0 |
|
|
Статистические показатели
|
M±m |
14,75±1,50 |
11,25±1,27 |
4,96±2,50 |
0 |
|
f |
1 |
1 |
0,5 |
0 |
|
|
Морские свинки, сенсибилизированные M.bovis, штамм БЦЖ (авирулентные) |
|||||
|
ППД туберкулин |
для млекопитающих |
для птиц |
|||
|
Доза туберкулина |
25 МЕ |
5 МЕ |
125 МЕ |
25 МЕ |
|
|
№ морской свинки |
1 |
16,5 |
14,5 |
11,5 |
0 |
|
2 |
16,5 |
16,5 |
11,0 |
0 |
|
|
3 |
15,0 |
12,5 |
8,5 |
0 |
|
|
4 |
15,5 |
10,5 |
12,0 |
0 |
|
|
5 |
18,5 |
12,5 |
10,0 |
0 |
|
|
6 |
17,5 |
14,0 |
12,0 |
0 |
|
|
Статистические показатели |
M±m |
16,58±0,74 |
13,41±1,19 |
10,50±0,76 |
0 |
|
f |
1 |
1 |
1 |
0 |
|
|
Морские свинки, сенсибилизированные M.bovis, штамм №8 (инактивированные) |
|||||
|
ППД туберкулин |
для млекопитающих |
для птиц |
|||
|
Доза туберкулина |
25 МЕ |
5 МЕ |
125 МЕ |
25 МЕ |
|
|
№ морской свинки
|
1 |
25,5 |
16,5 |
16,5 |
15,0 |
|
2 |
19,0 |
16,0 |
13,5 |
11,0 |
|
|
3 |
20,0 |
17,5 |
14,5 |
10,0 |
|
|
4 |
21,5 |
14,5 |
13,0 |
9,5 |
|
|
5 |
19,5 |
15,5 |
14,5 |
12,0 |
|
|
6 |
18,5 |
17,0 |
12,5 |
10,0 |
|
|
Статистические показатели |
M±m |
20,67±1,29* |
16,17±0,54* |
14,08±0,71 |
11,25±1,02 |
|
f |
1 |
1 |
1 |
1 |
|
Примечание:* разница достоверна при р< 0,05
Из полученных данных видно, что интенсивность реакций на дозы ППД для млекопитающих 25 и 5 МЕ достоверно выше в группе морских свинок, сенсибилизированных инактивированными микобактериями, – 20,67±1,29 и 16,17±0,54, в сравнении с контролем 14,75±1,50 и 11,25±1,27. Интенсивность аллергических реакций в группе морских свинок, сенсибилизированных авирулентными микобактериями, достоверно не отличается от контрольной группы морских свинок 16,58±0,74 и 13,41±1,19, относительно контроля 14,75±1,50 и 11,25±1,27. Сопоставление значений аллергических реакций в гомологичной системе на ППД-туберкулин для млекопитающих продемонстрировало предпочтительность варианта, в котором используются инактивированные микобактерии.
Сравнение специфичности по интенсивности аллергических реакций вариантов сенсибилизации морских свинок на ППД-туберкулин для птиц из-за отсутствия реакций в контрольной группе невозможна, поэтому сравнительные исследования осуществляли только по частоте аллергических реакций. Так, в группе животных, сенсибилизированных вирулентными микобактериями, частота аллергических реакций на дозу 125 МЕ ППД-туберкулина для птиц соответствовала 0,5, а при использовании дозы 25 МЕ – 0. В группе морских свинок, сенсибилизированных инактивированными микобактериями, частота проявления аллергических реакций на дозу 125 и 25 МЕ ППД-туберкулина для птиц соответствовала 1. В группе морских свинок, сенсибилизированных авирулентными микобактериями, частота проявления аллергических реакций на дозу 125 МЕ соответствовала 1 и на дозу 25 МЕ – 0. Исходя из полученных результатов видно, что модель, предполагающая использование авирулентных микобактерий, по специфичности является близкой к контрольному варианту, в то время как модель, предполагающая использование инактивированных микобактерий, является низкоспецифичной.
Таким образом установлено, что наиболее близкими параметрами инфекционной модели для проведения сравнений иммунобиологических характеристик является вариант, предполагающий использование живых авирулентных микобактерий.
Согласно исследованиям, проведённым ранее, было выявлено, что для получения оптимальной интенсивности иммунного ответа целесообразно использование дозировки микобактерий M.bovis BCG равной 0,2 мг. В свою очередь известно, что интенсивность течения туберкулёзного процесса зависит от пути введения микобактерий в организм, что также предположительно определяет интенсивность развития ПЧЗТ. Учитывая вышеизложенное, следующим этапом исследования была сравнительная оценка вариантов модели, предполагающих введение микобактерий различными путями. Введение микобактерий осуществляли следующими способами: внутрикожно, внутримышечно, интратрахеально, внутрибрюшинно. В исследовании было использовано четыре группы морских свинок по шесть особей в каждой. Принимая во внимание то, что внутрибрюшинное введение патогенных микобактерий определяет более интенсивное развитие инфекционного процесса, для осуществления сравнительного анализа данный вариант был использован как контрольный. Оценку вариантов проводили по интенсивности кожной реакции ПЧЗТ на ППД для млекопитающих в дозах: 25; 5; 1 МЕ. Результаты исследования представлены в таблице 2.
Таблица 2.
Интенсивность и частота кожной реакции ПЧЗТ на ППД для млекопитающих при различных способах введения микобактерий M.bovis БЦЖ
|
Морские свинки, сенсибилизированные внутрикожно |
||||
|
ППД-туберкулин для млекопитающих |
||||
|
Доза туберкулина |
25 МЕ |
5 МЕ |
1МЕ |
|
|
№ морской свинки
|
1 |
21,5 |
15,5 |
10,5 |
|
2 |
22,0 |
14,5 |
15,5 |
|
|
3 |
18,5 |
17,0 |
13,5 |
|
|
4 |
19,5 |
18,0 |
12,5 |
|
|
5 |
17,5 |
16,0 |
11,5 |
|
|
6 |
20,0 |
17,5 |
12,5 |
|
|
Статистические показатели |
M±m |
19,83±0,70 |
16,42±0,53 |
12,67±0,70 |
|
f |
1 |
1 |
1 |
|
|
Морские свинки, сенсибилизированные внутримышечно |
||||
|
ППД-туберкулин для млекопитающих |
||||
|
Доза туберкулина |
25 МЕ |
5 МЕ |
1МЕ |
|
|
№ морской свинки |
1 |
19,5 |
15,5 |
12,0 |
|
2 |
16,0 |
13,5 |
11,5 |
|
|
3 |
17,5 |
16,5 |
13,5 |
|
|
4 |
18,0 |
15,5 |
12,5 |
|
|
5 |
17,5 |
15,0 |
12,5 |
|
|
6 |
20,5 |
14,5 |
13,0 |
|
|
Статистические показатели |
M±m |
18,17±0,65 |
15,08±0,41 |
12,50±0,29 |
|
f |
1 |
1 |
1 |
|
|
Морские свинки, сенсибилизированные интратрахеально |
||||
|
ППД-туберкулин для млекопитающих |
||||
|
Доза туберкулина |
25 МЕ |
5 МЕ |
1МЕ |
|
|
№ морской свинки |
1 |
17,5 |
13,5 |
0 |
|
2 |
16,0 |
14,0 |
0 |
|
|
3 |
16,0 |
15,5 |
0 |
|
|
4 |
16,5 |
14,5 |
0 |
|
|
5 |
15,0 |
14,5 |
0 |
|
|
6 |
17,0 |
12,5 |
0 |
|
|
Статистические показатели |
M±m |
16,39±0,36* |
14,08±0,42* |
0 |
|
f |
1 |
1 |
0 |
|
|
Морские свинки, сенсибилизированные внутрибрюшинно |
||||
|
ППД-туберкулин для млекопитающих |
||||
|
Доза туберкулина |
25 МЕ |
5 МЕ |
1МЕ |
|
|
№ морской свинки |
1 |
20,0 |
17,5 |
13,5 |
|
2 |
19,5 |
14,5 |
11,0 |
|
|
3 |
17,5 |
16,5 |
12,0 |
|
|
4 |
20,0 |
17,5 |
14,5 |
|
|
5 |
17,5 |
15,5 |
12,5 |
|
|
6 |
20,0 |
16,5 |
13,5 |
|
|
Статистические показатели |
M±m |
19,08±0,51 |
16,33±0,48 |
12,83±0,51 |
|
f |
1 |
1 |
1 |
|
Примечание:* разница достоверна при р< 0,05
Из полученных данных видно, что достоверны более низкие значения реакций ПЧЗТ на разведения ППД-туберкулина для млекопитающих: 25 и 5 МЕ регистрировались при введении микобактерий интратрахеально (16,39±0,39 и 14,08±0,42 соответственно) при отсутствии реакций на дозу 1 МЕ (частота равна 0), что свидетельствует о пониженной чувствительности варианта сенсибилизации. Не выявлено различий в интенсивности и частоте реакций на ППД для млекопитающих в дозах 25, 5, 1 МЕ в группах морских свинок, сенсибилизированных внутрикожно, внутримышечно и внутрибрюшинно. Таким образом, варианты, предполагающие внутримышечный, внутрикожный и внутрибрюшинный методы введения микобактерий, являются вариантами выбора при тестировании иммунобиологических свойств микобактериальных аллергенов. При этом преимуществом будет являться вариант сенсибилизации, имеющий клинический критерий, позволяющий оценивать развитие ПЧЗТ. Последующие наблюдения за животными трёх групп (сенсибилизация внутримышечно, интратрахеально, внутрибрюшинно) не выявили специфических критериев. В то же время в группе морских свинок, которым микобактерии вводили внутрикожно, в месте введения была выявлена воспалительная реакция, интенсивность которой нарастала в течение 30 дней, после чего к 45 дню регрессировала с формированием рубцовой ткани. В свою очередь, предшествующими исследованиями была продемонстрирована положительная зависимость между интенсивностью кожной реакции ПЧЗТ и размером воспалительной реакции в месте введения микобактерий [2], предполагающая её использование как клинического критерия.
Выводы
1. Сенсибилизированные M.bovis, штамм БЦЖ, морские свинки являются оптимальной лабораторной моделью ПЧЗТ для проведения сравнительных исследований микобактериальных аллергенов. Данная модель характеризуется высокой степенью сходства с моделью, предполагающей использование вирулентных микобактерий M.bovis, штамм 8.
2. Вариант лабораторной модели туберкулёзной инфекции, предполагающий внутрикожное введение морским свинкам микобактерий M.bovis, штамм БЦЖ, характеризуется биобезопасностью, оптимальной интенсивностью развития кожной реакции ПЧЗТ и является наиболее приемлемым для оценки развития ПЧЗТ.
Заключение
Таким образом, вариант, предполагающий внутрикожное введение авирулентных микобактерий M.bovis БЦЖ, является оптимальным для проведения сравнительных исследований микобактериальных аллергенов и позволяет осуществлять оценку развития ПЧЗТ в организме морских свинок.
Литература
1. Безгин В.М. с соавт. Курская биофабрика 100 лет (1896 – 1996)/ В.М. Безгин, В.И. Гольцов, Б.Е. Григорьев и др.// Курск, 1996.- 608с.
2. Мясоедов, Ю.М. Сравнительный анализ критериев формирования групп морских свинок используемых для моделировании реакций гиперчувствительности замедленного типа / Ю.М.Мясоедов/ Вестник КГСХА №7. 2013. С.66-67.
3. Мясоедов, Ю.М. Оптимизация теста определения биологической активности ППД туберкулина для млекопитающих/ Мясоедов, Ю.М, Морозов С.В. /Вестник КГСХА 2012. №9 — с.71-74.
4. Найманов А.Х. с соавт. Проблемы диагностики микобактериальных инфекций крупного рогатого скота/А.Х. Найманов, Н.Г. Толстенко, Е.П. Вангели и др./ Ветеринария 2014. №6- с. 3-8.
5. Наставление по диагностике туберкулёза животных. Утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ 18 ноября 2002 г. — М. — 2002 г.- 63 с.
6. OIE Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals. — 6-th ed.-2008.-Vol.1. -P. 683-695.
