Оптимальная диагностическая доза ППД-туберкулина для млекопитающих при биологической пробе на лабораторных животных
Али Найманов
Ю. М. Мясоедов, ФКП «Курская биофабрика», начальник ОБТК, кандидат биологических наук, MyasoedovYurij@yandex.ru
В.М. Безгин, ФКП «Курская биофабрика», директор, доктор биологических наук, профессор.
В.Е. Козлов, ФКП «Курская биофабрика», заместитель директора по науке, доктор биологических наук, профессор.
А.Х. Найманов, ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко ФАНО России (ВИЭВ Россельхозакадемии), заведующий лабораторией микобактериозов ВИЭВ, доктор ветеринарных наук, профессор.
Резюме
В ранее проведённых исследованиях по определению биологической активности ППД-туберкулина для млекопитающих относительно Первого Международного стандарта PPD-bovine было установлено, что, в соответствии с наставлением по диагностике туберкулёза животных, [6] используемая для диагностики болезни крупного рогатого скота доза 10000 ТЕ ППД-туберкулина для млекопитающих эквивалентна величине активности, выраженной в международных единицах, – 2000 МЕ. При этом в контексте гармонизации нормативной документации с международными требованиями не определён эквивалент дозы ППД-туберкулина, используемой при осуществлении биологической пробы на лабораторных животных.
Целью исследований было определение эквивалента используемой для диагностики туберкулёза животных дозы туберкулиновых единиц (ТЕ) ППД-туберкулина для млекопитающих в международных единицах (МЕ), а также оценка эффективности диагностической дозы при использовании ППД-туберкулина для млекопитающих с различной биологической активностью при постановке биопробы на морских свинках.
В результате проведенных исследований было установлено, что 25 ТЕ (Международный стандарт PPD-S), используемые ранее при постановке биологической пробы, соответствуют 5 МЕ (Международный стандарт PPD-bovine). На инфицированных M. bovis БЦЖ морских свинках показано, что применение ППД-туберкулина для млекопитающих при всех допустимых величинах биологической активности (от 6600 до 15000 МЕ/см3) и стандартной схемы разведения (в 200 раз) позволяет получать дозировки туберкулина, в эксперименте выявляющие 100% инфицированных животных.
***
РФ является членом Всемирной торговой организации (ВТО) и, в соответствии с Руководством МЭБ «Manual of Diagnostic Tests and vaccines for Terrestrial Animals» [8], нам необходимо пользоваться стандартными методами диагностики туберкулёза у животных. Так, в руководстве МЭБ от 2012 года указано, что стандартным методом выявления туберкулёза бычьего вида у животных является внутрикожная туберкулиновая проба с использованием дозы ППД-туберкулина для млекопитающих 2000 международных единиц в 0,2 см3.
В России приказом Департамента ветеринарии МСХ РФ №33 от 11.01.2002 г. была создана комиссия в составе сотрудников Департамента, Курской биофабрики, ВГНКИ и ВИЭВ. Комиссией было установлено, что диагностическая доза ППД-туберкулина для млекопитающих, используемая для диагностики туберкулёза крупного рогатого скота и равная 10000 ТЕ (ранее использованных туберкулиновых единиц активности), эквивалентна 2000 МЕ Первого Международного стандарта PPD-bovine [1,4].
С 2008 года ППД-туберкулин для млекопитающих Курской биофабрикой выпускается в соответствии с Международными требованиями (СТО 00482909-0001-2011 и ГОСТ 32306-20013). Согласно этим нормативным документам величина биологической активности туберкулина выражается не в туберкулиновых единицах, а в международных единицах (МЕ) – 10000 МЕ/мг [1, 2, 5]. В соответствии с «Наставлениями по диагностике туберкулёза животных» от 2002 г. при использовании биологической пробы на морских свинках и кроликах применяются следующие дозы ППД туберкулина для млекопитающих: 25 и 50 ТЕ [6]. Эти дозы не соответствуют международным единицам, применяемым для выражения активности туберкулина в настоящее время [1].
В связи с изложенным, целью наших исследований было определение эквивалента туберкулиновых единиц (ТЕ) дозы ППД-туберкулина для млекопитающих, используемой для диагностики туберкулёза животных, в международных единицах (МЕ). Кроме этого, нас интересовала оценка эффективности диагностической дозы при использовании ППД-туберкулина для млекопитающих с различной биологической активностью при постановке биопробы на морских свинках.
Материалы и методы
В исследовании использовали 54 беспородных самок морских свинок, альбиносов, массой 500±100 г. Вся партия животных, используемая в экспериментах, одновременно получена из ФГБУН НЦБМТ ФМБА России, филиал «Андреевка». Особи содержались в вольерах на стандартном рационе кормления с использованием гранулированного корма.
Для инфицирования морских свинок использовали микобактерии бычьего вида – M. bovis, штамм БЦЖ, которые выращивали на картофельной среде Павловского в течение 25 суток, при температуре 37°С, после чего на физиологическом растворе готовили суспензию. Этой суспензией заражали 24 головы морских свинок внутрикожно в дозе 0,2 мг/0,1 см3, а 30 голов – подкожно в дозе 1 мг/см3. Через 30 дней после заражения животные были использованы в опытах.
В исследовании были использованы следующие микобактериальные аллергены: туберкулин очищенный ППД для млекопитающих, сублимированная форма, серия 3а, серия 4а (ФКП «Курская биофабрика»), а также Первый Международный стандарт PPD-bovine (NIBSC, Вейбридж).
Определение биологической активности туберкулинов в международных единицах осуществляли согласно методическим рекомендациям ВОЗ [7]. В свою очередь, одна международная единица – это наименьшее количество дозы в миллиграммах микобактериального белка, обеспечивающее выявление не менее чем 80% инфицированных особей в кожном тесте ПЧЗТ при интенсивности реакции не менее 5 мм [3].
Результаты исследований и обсуждения
В «Наставлении по диагностике туберкулёза животных» для оценки развития туберкулёза у морских свинок при постановке биопробы рекомендована доза ППД-туберкулина для млекопитающих – 25 ТЕ (PPD-S). В свою очередь, величина биологической активности упомянутой дозировки туберкулина определена относительно Международного стандарта PPD-S, не используемого в настоящее время. В Российской Федерации аналогом Международного стандарта PPD-S является ППД-туберкулин для млекопитающих из серии 3а, активность которого составляет 50000 МЕ/мг [1]. Используя значение активности, полученное при применении аналога PPD-S и PPD-bovine, можно определить соотношение между единицами активности, применяемые ранее и в настоящее время. Для проведения сравнительных исследований был приготовлен новый эталонный образец ППД для млекопитающих, серия 4а, и расфасован в ампулы, так как в условиях вакуума обеспечивается более длительное время сохранения биологических свойств, чем при использовании фасовки препарата во флаконы. Определение вариабельности содержания туберкулина в выборке ампул продемонстрировало низкие показатели (менее 0,9%), приемлемые для эталонных препаратов.
Определение биологической активности ППД для млекопитающих из серии 4а относительно предшествующего стандарта ППД для млекопитающих, серия 3а, выявило активность, равную 50000 ТЕ/мг (PPD-S). Последующее определение биологической активности ППД для млекопитающих, серия 4а, относительно Международного стандарта PPD-bovine продемонстрировало значение биологической активности, соответствующее 10000 МЕ/см3/мг. Принимая во внимание значения активности относительно PPD-S и PPD-bovine в миллиграмме препарата 4а, получаем соотношение: 50000/10000 = 5. Таким образом, дозировка ППД-туберкулина для млекопитающих – 25 ТЕ (PPD-S), использованная ранее, соответствует дозе 5 МЕ. Соответственно, 50 ТЕ (PPD-S) = 10 МЕ (PPD- bovine).
В нормативной документации определены границы биологической активности серий ППД-туберкулина для млекопитающих, имеющие значение от 6600 до 15000 (PPD-bovine) на миллиграмм. Если использовать при этом стандартную схему разведения коммерческих серий ППД-туберкулина (в двести раз), количество МЕ будет различным, что может оказать влияние на конечный результат. Поэтому следующим этапом исследований была оценка диагностической ценности разведения ППД-туберкулина (по стандартной схеме) опытно-промышленных серий с различной биологической активностью. Для этого провели подбор образцов ППД-туберкулина для млекопитающих с крайним и номинальным значением биологической активности (относительно нового стандарта туберкулина для млекопитающих). В результате были определены три образца, отвечающих заданным требованиям с величиной биологической активности 6600 МЕ, 10000 МЕ и 15000 МЕ.
Исходя из значения величины и биологической активности серий препарата со значением 6600 МЕ/см3, при использовании стандартного разведения дозировка будет соответствовать 3,3 МЕ/0,1 см3. Если брать препарат с активностью 10000 МЕ/см3
– 5 МЕ/0,1 см3. Есили же это серия аллергена с показателем активности 15000 МЕ/см3 – 7,5 МЕ/0,1 см3. Исследования были осуществлены на трёх группах морских свинок, инфицированных M. bovis БЦЖ в дозе 1 мг/см3, по 10 голов в каждой. Результаты исследования представлены в таблице 1.
Таблица 1
Определение диагностической ценности разведений ППД-туберкулина для млекопитающих с различным содержанием МЕ
|
№ морской свинки
|
Группа морских свинок |
||
|
1 |
2 |
3 |
|
|
Биологическая активность ППД-туберкулина (PPD-bovine) |
|||
|
6600 МЕ/см3 72-140% |
10000 МЕ/см3 70-143% |
15000 МЕ/см3 60-166% |
|
|
Содержание МЕ в дозе |
|||
|
3,3 МЕ/0,1см3 |
5,0 МЕ/0,1см3 |
7,5 МЕ/0,1см3 |
|
|
Интенсивность кожной реакции ПЧЗТ, мм |
|||
|
1 |
15,0 |
19,0 |
20,0 |
|
2 |
12,5 |
16,0 |
18,0 |
|
3 |
12,0 |
14,0 |
17,0 |
|
4 |
16,0 |
13,0 |
16,0 |
|
5 |
14,5 |
14,5 |
16,5 |
|
6 |
13,5 |
14,0 |
18,0 |
|
7 |
14,5 |
17,5 |
17,0 |
|
8 |
16,0 |
13,0 |
15,5 |
|
9 |
14,5 |
13,0 |
15,0 |
|
10 |
14,0 |
13,5 |
15,5 |
|
M±m |
14,25±0,42 мм |
14,75±0,66 мм |
16,85±0,48 мм |
Диагностическую ценность разведения ППД-туберкулина для млекопитающих с различным содержанием МЕ определяли по интенсивности кожной реакции ПЧЗТ. Интенсивность реакции 5 мм и более считали положительным результатом [6]. Из полученных данных видно, что интенсивность аллергической реакции во всех группах и у всех животных превышала значение 5 мм, а при сопоставлении значений 1, 2 и 3 групп установлено повышение интенсивности кожной реакции с увеличением содержания МЕ в дозе. Таким образом, использование коммерческих серий ППД-туберкулина для млекопитающих в диапазоне 6600-15000 МЕ и стандартного разведения, обуславливающего содержание 3,3-7,5 МЕ в 0,1см3, позволяет получать валидные результаты исследования.
Выводы
1. Действующая эталонная серия туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих характеризуется минимальным значением коэффициента вариации микобактериальных белков в ампуле, обеспечивающей получение валидных результатов определения величины биологической активности коммерческих серий ППД-туберкулина для млекопитающих.
2. Перерасчёт величины единиц биологической активности ППД-туберкулина для млекопитающих при осуществлении биопробы на морских свинках продемонстрировал, что ранее используемая диагностическая доза 25 ТЕ (PPD-S) соответствует дозе 5 МЕ (PPD-bovine).
3. На инфицированных M. bovis БЦЖ морских свинках показано, что при постановке биопробы применение ППД-туберкулина для млекопитающих со значениями величины биологической активности от 6600 до 15000 МЕ позволяет выявить в условиях эксперимента 100% инфицированных животных.
Литература
1. Козлов В.Е., Безгин В.М., Шумилов К.В., Букова Н.К., Найманов А.Х., Мясоедов Ю.М. Оценка активности национального стандарта туберкулина (ППД) для млекопитающих относительно 1-го международного стандарта туберкулина (PPD) bovine / Ветеринарная патология. №1-2(9). 2004 г. – С. 85-89.
2. Козлов В.Е., Букова Н.К., Найманов А.Х. Оценка активности и специфичности коммерческих серий туберкулина (ППД) для млекопитающих отечественного и зарубежного производства/ Ветеринарная патология №1-2(9).2004 г. – С.89-92.
3. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. 36 докл. Серия тех. докладов 745. – ВОЗ Женева. –1988 г. – С. 29-49.
4. Найманов АХ., Гулюкин М.И. Микобактериальные инфекции крупного рогатого скота (туберкулёз, паратуберкулёз). Москва, 2014 г. 235с.
5. Найманов А.Х., Устинова Г.И., Толстенко Н.Г., Вангели Е.П., Кучерку О.Д. Экспериментальные данные по изучению сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий и близкородственных бактерий Nocardia и Rodococcus/ Ветеринария и кормление № 6. 2015 г. – С. 11-13.
6. Наставление по диагностике туберкулёза животных. Утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ 18 ноября 2002 г. – М. – 2002 г. – 63 с.
7. Фрадкин, В.А. Диагностические и лечебные аллергены/ В.А. Фрадкин// М.: Медицина, 1990 г. – С. 52-53.
8. OIE. World Organization for Animal Health. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2012. Chapter 2.4.7. Bovine tuberculosis. – Vol. 1. – 2012. http://www.oie.nt//fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm
