Обоснование создания комплексных аллергенов для дифференциальной диагностики туберкулёза
Али Найманов
А.Х.Найманов, д.в.н., профессор, заведующий лабораторией микобактериозов, labmyc@mail.ru
Г.И.Устинова, к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии и молекулярной биологии
Н.Г.Толстенко, к.в.н., ведущий научный сотрудник лаборатории микобактериозов
Е.П.Вангели, к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории микобактериозов О.Д.Кучерук, к.в.н., старший научный сотрудник лаборатории биохимии и молекулярной биологии
В.М.Калмыков, к.в.н., старший научный сотрудник лаборатории микобактериозов
Е.М.Сошникова, к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории биохимии и молекулярной биологии
ФГБНУ Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ)
Резюме
Представлены результаты исследований и обоснование теоретических и практических основ необходимости создания нового комплексного аллергена из нетуберкулёзных микобактерий (НТМБ) для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин. Установлено, что на территории Российской Федерации от реагирующих на туберкулин животных с неспецифическими реакциями до 75% случаев выделяются быстрорастущие НТМБ 4 группы по классификации Раньона.
Комплексный аллерген из микобактерий (КАМ), используемый в ветеринарной практике с 1978 года, готовится из двух видов атипичных микобактерий: M.scrofulaceum (2 группа) и M.intracellulare (3 группа).
Авторы считают, что на современном этапе борьбы с туберкулёзом крупного рогатого скота КАМ необходимо готовить из наиболее часто выделяемых микобактерий 2, 3 и 4 групп, обладающих сенсибилизирующими свойствами. На сенсибилизированных различными видами микобактерий морских свинках установлено, что из НТМБ 4 группы наибольшими сенсибилизирующими свойствами обладают M.fortuitum и M.scrofulaceum.
Основываясь на проведенных исследованиях, в ВИЭВ разработаны новые комплексные аллергены КАМ-2 и КАМ-3, изготовленные из микобактерий 2, 3 и 4 групп.
***
Атипичные микобактерии (нетуберкулёзные микобактерии, НТМБ) широко распространены в природе. НТМБ выделяются повсеместно в различных федеральных округах и климатических зонах Российской Федерации. Анализ выявления этих бактерий на территории нашей страны показывает, что наиболее часто от реагирующих животных с неспецифическими реакциями на туберкулин выделяются быстрорастущие НТМБ 4 группы по классификации Раньона.
Г.К.Параскевов (1988) при исследовании 1033 проб биоматериала от реагировавших на туберкулин животных в 63 случаях выделял микобактерии, из них: 4 (6,3%) – патогенные, а 59 (93,6%) – атипичные. Причём, основную долю (до 77,7%) составляли атипичные быстрорастущие микобактерии 4 группы по классификации Раньона.
Анализ проведённых в ВИЭВ исследований показывает, что при бактериологическом анализе биоматериала от реагировавших на туберкулин животных из благополучных по туберкулёзу хозяйств в большинстве случаев выделяются быстрорастущие атипичные микобактерии 4 группы по Раньону. Отчётные данные производственных ветеринарных лабораторий также подтверждают результаты этих исследований. Так, на территории России ветеринарные лаборатории выделяют атипичные микобактерии в следующем соотношении: 1 группа – 2,0%; 2 группа – 19,7%; 3 группа – 16,8%; 4 группа – 59,5% (А.Х.Найманов, 2004).
Н.С.Боганец (2006) указывает, что ветеринарные лаборатории выделяют атипичные микобактерии: 1 группа – 3,9%; 2 группа – 22,3%; 3 группа – 14,7%; 4 группа – 59,2%. В Сибирском регионе наиболее часто выделяют атипичные микобактерии 4 группы: M.phlei – 12,5%; M.peregrinum – 11,1%; M.smegmatis – 10,1%; M.fortuitum – 8,3%.
М.В.Качкин (2007) в благополучных по туберкулёзу хозяйствах Новосибирской области выделял атипичные микобактерии, которые по групповому составу распределялись: 1 группа – 3,1%; 2 группа – 15,6%; 3 группа – 12,5%; 4 группа – 65,7%.
Н.И.Прокопьева (2004), М.П.Неустроев и соавт. (2009), Н.А.Обоева (2010) установили, что в Якутии у реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота персистируют атипичные микобактерии, близкородственные микроорганизмы Nocardia и Rhodococcus, а также грибы рода Aspergillis. Причем атипичные микобактерии 4 группы выявляются до 75,0% случаев.
А.С.Донченко и соавт. (2011) считают, что основная причина проявления неспецифических реакций на туберкулин в благополучных хозяйствах – сенсибилизация крупного рогатого скота быстрорастущими атипичными микобактериями 4 группы: M.fortuitum и M.smegmatis.
Представленные результаты различных авторов показывают, что на территории России повсеместно выделяются НТМБ, значительную часть которых (от 59,2 до 75,0%) составляют быстрорастущие микобактерии 4 группы по классификации Раньона.
Со времени возникновения проблемы неспецифических реакций были предложены различные методы их дифференциации, однако наибольшее признание и распространение во всем мире получил метод симультанной пробы с туберкулином для млекопитающих и для птиц.
В настоящее время в нашей стране для дифференциации неспецифических реакций применяют симультанную пробу с ППД для млекопитающих и КАМ, а также симультанную пробу с ППД для млекопитающих и ППД для птиц.
Сведения об эффективности этих проб противоречивы. Так, одни авторы считают, что они обладают одинаковой эффективностью, вторые считают более эффективной симультанную пробу с ППД для птиц, третьи – симультанную пробу с КАМ.
В связи с тем, что в последние годы в благополучных хозяйствах Российской Федерации в основном устанавливают сенсибилизацию крупного рогатого скота атипичными микобактериями, а сенсибилизация M.avium выявляется редко, считается, что для дифференциации неспецифических реакций предпочтительно применять симультанную пробу с ППД для млекопитающих и КАМ.
Основным недостатком симультанной пробы является небольшая её эффективность, так как по сообщениям различных авторов из разных регионов симультанная проба с ППД для млекопитающих и КАМ позволяет дифференцировать неспецифические реакции от 0 до 77% случаев. Кроме того, в соответствии с действующим наставлением, она является групповой и дает возможность ориентироваться в ситуации по туберкулёзу лишь в целом по стаду или группе (не менее шести голов) исследуемых животных.
Следует указать и тот факт, что в последние годы при использовании симультанной пробы с КАМ всё чаще стали получать неопределённые результаты исследований при групповом учёте результатов симультанной пробы.
Тем не менее, мы считаем, что главная диагностическая ценность симультанной пробы в том, что при её применении значительно сокращается количество реагирующих на туберкулин животных. Диагностическому убою подлежат только животные, более интенсивно реагирующие на туберкулин или при их отсутствии – реагирующие в равной степени на ППД для млекопитающих и КАМ.
Проведённые нами исследования показывают, что учёт результатов симультанной пробы следует проводить индивидуально по каждой корове, так как в последние годы при групповом учете симультанной пробы и использовании таблицы ведомости учета и таблицы определения достоверности различия реакций на туберкулин и КАМ, практически всегда получаются неопределённые результаты исследований.
Следует учитывать и тот факт, что, в соответствии с утверждёнными нормативными документами, симультанная туберкулиновая проба используется в благополучных хозяйствах в целях дифференциации неспецифических реакций. В благополучных стадах реагирующие животные считаются только подозреваемыми в заражении туберкулёзом. Решающим в установлении диагноза является патологоанатомическое или лабораторное подтверждение туберкулёза у убитых с диагностической целью животных.
Поэтому, учитывая широкое распространение нетуберкулёзных микобактерий, недостаточную изученность и противоречивые данные о сенсибилизирующих свойствах различных видов микобактерий, мы провели исследования по изучению сенсибилизирующих свойств этих микроорганизмов с целью выявления отдельных видов микобактерий, обладающих наибольшими сенсибилизирующими свойствами, для создания нового поколения КАМ.
Материалы и методы
Исследования по изучению сенсибилизирующей роли атипичных микобактерий, а также близкородственных бактерий Nocardia и Rhodococcus провели в Вышневолоцком филиале ВИЭВ (остров Лисий) на морских свинках. Предварительно всех морских свинок исследовали внутрикожной пробой с ППД для млекопитающих в дозе 5 МЕ (25 ТЕ) в 0,1 мл физиологического раствора. В опыт брали только морских свинок, не реагировавших на внутрикожное введение туберкулина. Морских свинок заражали M.fortuitum, M.smegmatis, M.chelonei, M.vaccae, M.phlei, M.flavescens, M.peregrinum, M. intracellulare, M.scrofulaceum, N.transvalensis и R.bronchialis в дозе 5 мг влажной бакмассы культуры микроорганизма в 1 мл физиологического раствора.
Через 21–30 суток после подкожного заражения морских свинок исследовали симультанной пробой с ППД-туберкулином для млекопитающих в дозе 5 МЕ (25 ТЕ) и КАМ в дозе 10 ЕД, в объёме 0,1 мл физиологического раствора внутрикожно с левой и правой стороны в депилированные участки кожи на боках животных. Учёт аллергических реакций проводили через 24–48 часов. За положительную реакцию принимали гиперемию кожи и образование припухлости диаметром 5 мм и более в месте введения аллергенов.
Результаты исследований
Установлено, что при заражении морских свинок культурами микобактерий в дозе 5 мг в 1 мл физиологического раствора большое количество реагирующих животных выявлено при заражении M. intracellulare (3 группа), M.scrofulaceum (2 группа), M.fortuitum, M.smegmatis, M.chelonei и M.flavescens (4 группа). Причём морские свинки реагировали на КАМ и на ППД для млекопитающих (кроме заражённых M.flavescens и M.peregrinum, которые реагировали только на КАМ).
Морские свинки, заражённые нокардиями, родококками и M.phlei, не реагировали на внутрикожное введение КАМ и ППД для млекопитающих.
Проведённые нами исследования показали, что при заражении культурами микобактерий в дозе 5 мг в 1 мл достигается определенный уровень сенсибилизации у морских свинок. Тем не менее, на эту дозу не реагировали животные, зараженные N.transvalensis, R.bronchialis и M.phlei.
На основании проведённых исследований и анализа результатов этих исследований в ВИЭВ разработаны две опытные лабораторные серии комплексного аллергена из микобактерий КАМ-2 и КАМ-3. КАМ-2 – это опытная лабораторная серия комплексного аллергена из НТМБ, изготовленная из четырёх видов, наиболее часто выделяемых на территории России и обладающих сенсибилизирующими свойствами атипичных микобактерий 2, 3 и 4 группы по классификации Раньона (M.scrofulaceum – 2 группа, M.intracellulare – 3 группа, M.fortuitum и M.smegmatis – 4 группа). КАМ-3 – это опытная лабораторная серия комплексного аллергена из НТМБ, изготовленная из трёх основных видов микобактерий, входящих в состав ППД туберкулина для птиц (M.avium шт. 2282, 3 группа), КАМ (M.scrofulaceum – 2 группа), КАМ-2 (M.fortuitum – 4 группа).
При сравнительном изучении диагностической ценности и дифференцирующей способности ППД-туберкулина для птиц, КАМ, КАМ-2 и КАМ-3 на сенсибилизированных различными видами микобактерий морских свинках установлено, что КАМ-3 по активности и специфичности превосходит все испытанные аллергены.
В настоящее время проводятся сравнительные испытания диагностической ценности биофабричного КАМ и опытных лабораторных серий КАМ-2 и КАМ-3 в благополучных по туберкулёзу хозяйствах, где выявляются реагирующие животные с неспецифическими реакциями на туберкулин.
Выводы
1. На территории Российской Федерации от реагирующих животных с неспецифическими реакциями на туберкулин и различных объектов внешней среды выделяются НТМБ: 1 группа – 2,0%; 2 группа – 19,7%; 3 группа – 16,8%; 4 группа – 59,5%.
2. В связи с широким распространением во внешней среде и выделением от реагирующих животных указанных бактерий для дифференциации неспецифических реакций целесообразно использование симультанной пробы с ППД-туберкулином для млекопитающих и комплексного аллергена из микобактерий (КАМ).
3. В связи с тем, что сенсибилизацию организма крупного рогатого скота к туберкулину вызывают НТМБ 2, 3 и 4 групп по Раньону, комплексный аллерген из микобактерий необходимо готовить из микобактерий указанных групп.
4. Из медленнорастущих НТМБ значительными сенсибилизирующими свойствами обладают M.intracellulare (3 группа) и M.scrofulaceum (2 группа). Из быстрорастущих микобактерий 4 группы наибольшими сенсибилизирующими свойствами обладают M.fortuitum и M.smegmatis.
Заключение
В ВИЭВ изготовлены опытные лабораторные серии КАМ-2 и КАМ-3. КАМ-2 получен из четырёх видов атипичных микобактерий 2, 3 и 4 групп по классификации Раньона (M.scrofulaceum – 2 группа, M.intracellulare – 3 группа, M.fortuitum и M.smegmatis – 4 грeggf). КАМ-3 изготовлен из трёх основных видов микобактерий, входящих в состав ППД-туберкулина для птиц (M.avium шт.2282, 3 группа), КАМ (M.scrofulaceum – 2 группа), КАМ-2 (M.fortuitum – 4 группа).
Литература
1. Боганец Н.С. Бактериологическая диагностика туберкулёза животных и её усовершенствование: автореф. дис. докт. вет. наук. – Омск, 2006. – 38 с.
2. Донченко А.С., Кисленко В.Н., Донченко Н.А. и др. Диагностика туберкулёза животных. – Новосибирск, 2011. – 246 с.
3. Качкин М.В. Комплексная оценка проявления туберкулиновых реакций у животных на территориальном и популяционном уровне с использованием информационных технологий: автореф. дис. канд. вет. наук. – Новосибирск, 2007. – 22 с.
4. Найманов А.Х. Аллергическая диагностика микобактериальных инфекций крупного рогатого скота: дисс. докт. вет. наук. – Москва, 1993. – 354 с.
5. Найманов А.Х. Проблемы диагностики и профилактики туберкулёза крупного рогатого скота в современных условиях / Ветеринарная патология. – 2004. – № 1 – 2 (9). – С. 18 – 23.
6. Найманов А.Х., Устинова Г.И., Толстенко Н.Г., Вангели Е.П., Кучерук О.Д. Проблема неспецифических реакций на туберкулин и совершенствование симультанной пробы для дифференциальной диагностики туберкулёза крупного рогатого скота // Ветеринария. – 2015 г. – № 6. – С. 20 – 25.
7. Неустроев М.П., Прокопьева Н.И., Протодьякова Г.П. Мониторинг эпизоотической ситуации по туберкулёзу крупного рогатого скота в республике Саха (Якутия) / Сб. науч. трудов ВНИИБТЖ. – 2009. – С. 140 – 143.
8. Овдиенко Н.П., Косенко В.И., Найманов А.Х. и др. Видовая принадлежность микобактерий, выделяемых от крупного рогатого скота и из объектов внешней среды / Проблемы туберкулёза. – 1990. – № 1. – С. 46 – 48.
9. Параскевов Г.К. Причины сенсибилизации крупного рогатого скота к туберкулёзу и мероприятия в хозяйствах в зависимости от вида микобактерий: автореф. дис. канд. вет. наук. – Тбилиси, 1988. – 18 с.
10. Прокопьева Н.И. Особенности контроля эпизоотического процесса туберкулёза крупного рогатого скота в экстремальных условиях Якутии: автореф. дис. докт. вет. наук. – Новосибирск, 2004. – 35 с.
11.Шаров А.Н. Аллергическая диагностика туберкулеза у животных: повышение её эффективности: дисс. докт. вет. наук. – Москва, 1989. – 373 с.
