Влияние спиртовой настойки восковой моли на рост микобактерий
Али Найманов
Найманов А.Х. – доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий лабораторией микобактериозов, labmyc@mail.ru
Сотников А.Н. – кандидат ветеринарных наук, заведующий лабораторией болезни пчел
Толстенко Н.Г. – кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник лаборатории микобактериозов
Вангели Е.П. – кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории микобактериозов
ВИЭВ
***
Представлены результаты проведенных исследований воздействия на рост референтных штаммов культур M.bovis (8 шт.), M.avium (780 шт.) и M.phlei (6–78 шт.) 40%-ной и 90%-ной спиртовой настойки молодых личинок восковой моли.
Исследования проводили в два этапа: первый этап – спиртовую настойку из личинок восковой моли добавляли в питательную среду Левенштейна-Йенсена; второй этап – спиртовую настойку из личинок восковой моли в течение 15 минут наносили на культуры микобактерий, затем эти культуры засевали на поверхность питательной среды Левенштейна–Йенсена. Установлено, что спиртовая настойка восковой моли в 40% и 90% концентрации оказывает воздействие на культуральные свойства микобактерий в виде ослабления роста и снижения интенсивности роста микобактерий.
***
Туберкулез был и остается одним из самых распространенных и сложных инфекционных заболеваний человека и животных, для которого до настоящего времени не разработаны высокоэффективные средства иммунной защиты и лечения (А.Х. Найманов, М.И. Гулюкин, 2014).
Н.Б. Найговзина и соавт. (2009), И.С. Концевая и соавт., (2011) указывают, что Российская Федерация входит в число стран, в которых туберкулез остается важной проблемой здравоохранения. Особенностью эпидемиологии туберкулеза является сочетание его с ВИЧ-инфекцией, а также значительное распространение лекарственной устойчивости, включая множественную лекарственную устойчивость (МЛУ), которая достигает 20% среди впервые выявленных пациентов и свыше 50% – среди ранее леченных пациентов. Особую тревогу вызывает распространение штаммов с обширной лекарственной устойчивостью, то есть, устойчивых практически ко всем группам противотуберкулезных препаратов.
История открытия и изучения различных видов микобактерий восходит к 1882 году, когда Р. Кох впервые обнаружил мельчайшие изогнутые палочки возбудителя туберкулеза и в эксперименте по заражению лабораторных животных доказал, что именно эти микроорганизмы вызывают заболевание. В дальнейшем были открыты и многие другие виды патогенных и непатогенных микобактерий. Со времен Коха существовало предположение, что микобактерии туберкулеза имеют воскоподобную оболочку, которая обусловливает их кислотоустойчивость. Впоследствии было установлено, что в химический состав микобактерий входят жиры, белки, углеводы и минеральные соли, значительную часть составляют липиды. У различных видов микобактерий туберкулеза липиды составляют от 10 до 40% их массы.
Микобактерии объединены общим признаком – способностью стойко сохранять воспринятую окраску, даже после воздействия разных кислот, щелочей и спирта. Поэтому они являются кислото-, щелоче- и спиртоустойчивыми. Кислотоустойчивость связана с липидными фракциями микобактерий (Р.О. Драбкина,1963; А.П. Аликаева, 1963; О.В. Мартма, 1990; C. Ratledce, V. Stanford, 1983).
Микобактерии содержат растворимые в хлороформе миколовые кислоты с длинными разветвленными цепями от 60 до 90 атомов углерода. Содержание Г+Ц (гуанин + цитазин) в ДНК колеблется от 62 до 70% (Т.Ф. Оттен, А.В. Васильев, 2005).
Микобактерии обладают уникальными биологическими свойствами – способностью к длительному сосуществованию с макроорганизмом, адаптивностью к размножению в организме различных видов животных и человека, высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям внешней среды.
По мнению многих исследователей, микобактерии туберкулеза окружены оболочкой, состоящей из особого жирового вещества, похожего по своим свойствам на воск. Считается, что восковая оболочка микобактерий придает устойчивость к неблагоприятным воздействиям окружающей внешней среды и предохраняет от переваривания в соках и клетках живого организма.
Дж. Уотсон (1978), Б. Альбертс и соавт. (1986) при электронной микроскопии и фотографировании установили, что снаружи бактерии окружены жесткой защитной оболочкой, состоящей из белков, полисахаридов и липидов. За оболочкой находится эластичная клеточная мембрана. Эта мембрана полупроницаемая и определяет, какие молекулы поступают в клетку или выходят из нее. Приблизительно пятая часть внутреннего объема клетки занята ДНК (ответственной за передачу генетической информации от одной клетки к другой), а также РНК, белками и малыми молекулами.
Известно, что восковая моль (Galleria mellonilla) – одно из живых существ, эволюционно приспособленных к обитанию в пчелином улье, и cвое название она получила за уникальную способность переваривать и усваивать пчелиный воск. Развиваясь в ульях, личинки восковой моли разрушают соты, повреждают расплод пчел, а при массовом размножении могут опустошить склад воскового сырья. Эти вредные для пчеловодства свойства восковой моли с древнейших времен использовали в медицинских и косметических целях. Так, в народной медицине рекомендовалось лечить чахотку и другие легочные заболевания настойкой личинок восковой моли. История этого вопроса восходит к И.И. Мечникову, который еще в 1889 году полагал, что пищеварительные ферменты этого странного, питающегося пчелиным воском насекомого могут разрушить воскоподобную оболочку микобактерий туберкулеза. Автор установил, что способные к окукливанию старые личинки не переваривают микобактерии туберкулеза, а молодые личинки в период роста – отлично переваривают.
Поэтому, учитывая широкое распространение туберкулеза среди людей и животных, значительное распространение штаммов микобактерий с лекарственной устойчивостью и множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) ко всем группам противотуберкулезных препаратов, недостаточную изученность и противоречивостью данных по многим вопросам диагностики и оздоровительных мероприятий при туберкулезе животных мы провели свои исследования по воздействию спиртовой настойки молодых личинок восковой моли на культуральные свойства M.bovis, M.avium и M.phlei.
Материалы и методы
Работу проводили в лабораториях микобактериозов и болезней пчел Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) и Вышневолоцком филиале ВИЭВ на о. Лисий.
Для исследования использовали референтные штаммы различных видов микобактерий: M.Bovis штамм 8, M.avium штамм 780, M.phlei штаммы 6-78.
Исследования проводили в два этапа: первый этап – определяли степень воздействия на культуры микобактерий 40% спиртовой настойки восковой моли после добавления ее в питательную среду Левенштейна–Йенсена на стадии разлива в пробирки, до скашивания. В качестве контроля использовали нативную среду Левенштейна–Йенсена без добавления настойки восковой моли.
Второй этап включал исследования по изучению непосредственного воздействия спиртовой настойки восковой моли в концентрации 40% и 90%, а также этилового спирта 40%-ной концентрации на культуры микобактерий. Экспозицию культур разных видов микобактерий в жидкостях проводили в течение 15 минут. Затем культуры наносили на поверхность питательной среды.
Культуральные исследования проводили в соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулеза животных» (М., 2002).
Результаты исследований
Результаты проведенных исследований представлены в таблице.
Анализ полученных результатов показывает, что 15-минутная экспозиция культур в настойке восковой моли 40%-ной и 90%-ной концентрации оказывает некоторое влияние на культуральные свойства микобактерий. Установлено снижение интенсивности роста микобактерий (гр. 3-4-5). Также установлено изменение культуральных свойств микобактерий. Отмечался рост точечных единичных колоний. Однако подобный эффект наблюдали и при экспозиции культур микобактерий в этиловом спирте 40%-ной концентрации.
Добавление настойки личинок восковой моли в питательную среду не вызывало заметного воздействия на рост микобактерий (гр. 1-2).
Из данных таблицы также видно, что в среде с добавкой спиртовой настойки восковой моли отмечен рост культуры M.bovis в 7 из 7 посеянных пробирок, M.avium – в 5 из 7, а также M.phlei, соответственно, в 7 из 7.
После экспозиции в 40%-ной спиртовой настойке восковой моли рост микобактерий был отмечен M.bovis в 5 из 7 пробирок культуры, M.avium – в 1 из 7 пробирок; и M.phlei в 4 из 7 пробирок.
Таблица 1
|
№ п/п |
|
M.bovis Шт.8 |
M.avium Шт. 780 |
M.phlei Шт. 6-78 |
|
1. |
Рост в среде с добавкой |
7/7 |
5/7 |
7/7 |
|
2. |
Рост культуры после обработки культуры 40%-ной настойкой |
5/7 |
1/7 |
4/7 |
|
3. |
Рост культуры после обработки 90%-ной настойкой |
2/7 |
0/7 |
2/7 |
|
4. |
Рост культуры после обработки 40%-ным этиловым спиртом |
2/7 |
2/7 |
3/7 |
|
5. |
Рост на среде без добавок (контроль) |
7/7 |
7/7 |
7/7 |
Примечание: 7/7 – количество пробирок, где отмечен рост микобактерий/ общее количество пробирок.
При испытании 90%-ной спиртовой настойки восковой моли установили снижение активности роста всех видов микобактерий. Так, при посевах культур M.bovis шт.8 отмечен рост только в 2 из 7 пробирок, M.avium шт. 780 – рост отсутствовал, M.phlei шт.6-78 – также отмечался рост в 2 из 7 пробирок, т.е. как и M.bovis.
При экспозиции культур микобактерий в 40%-ном этиловом спирте установили следующие результаты: M.bovis шт.8 – рост в 2 из 7 пробирок, M.avium шт. 780 – в 1 из 7 пробирок, M.phlei шт.6-78 – в 3 из 7 пробирок.
Полученные результаты исследований показывают, что спиртовая настойка восковой моли 40%-ной и 90%-ной концентрации оказывает определенное воздействие на культуральные свойства микобактерий. Однако такое же действие на рост микроорганизмов оказывает и этиловый спирт при аналогичных условиях экспозиции.
Проведенные нами исследования, полученные результаты и анализ данных позволяют сделать заключение. Спиртовая настойка молодых личинок восковой моли в 40%-ной и 90%-ной концентрации влияет на интенсивность роста и ростовые свойства культур M.bovis, M.avium и M.phlei.
Литература
1. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки / Издательство «Мир», Москва, 1986, 11.2.7, 223с.
2. Концевая И.С., Николаевский В.В., Балабанова Я.М. Молекулярная эпидемиология туберкулеза: задачи, методы, перспективы. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2011, №1,
с. 3–10.
3. Найговзина Н.Б., Филатов Ф.Б., Ерохин В.В. и др. Туберкулез в Российской Федерации / Эпидемиология и инфекционные болезни, 2009, №3, с. 4-11
4. Найманов А.Х., Гулюкин М.И. Микобактериальные инфекции крупного рогатого скота (туберкулез, паратуберкулез), г. Москва, «Зооветкнига», 2014, 236с.
5. Оттен Т.Ф., Васильев А.В. Микобактериозы, г. Санкт-Петербург / Издательство Медицинская пресса, 2005, 218с.
6. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена / Издательство «Мир», Москва, 1978, 9.5.6, 720с.
