Воспроизведение туберкулёза на лабораторных животных
Али Найманов
А. Х. Найманов,
доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий
лабораторией микобактериозов ФГБНУ ВИЭВ,
Москва, Российская Федерация
E-mail: labmyc@mail.ru
В.М. Калмыков,
кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник
лаборатории микобактериозов ФГБНУ ВИЭВ,
Москва, Российская Федерация.
М.С. Калмыкова,
кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры радиобиологии и вирусологии имени академиков А.Д. Белова и В.Н. Сюрина,
ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К. И. Скрябина,
Москва, Российская Федерация.
***
В статье представлен обзор и анализ отечественной литературы и нормативных документов о возможности воспроизведения туберкулёза на лабораторных животных. Указаны разные методы заражения, сроки выявления характерных для болезни изменений на морских свинках, кроликах и курах. Представлена оценка достоинств и недостатков биологической пробы на лабораторных животных.
Показано, что и на современном этапе борьбы с туберкулёзом животных биопроба остаётся наиболее точным и надёжным методом подтверждения диагноза.
***
Туберкулёз был и остаётся одним из широко распространённых инфекционных заболеваний человека и животных, при котором до настоящего времени не разработаны высокоэффективные средства иммунной защиты и лечения. Поэтому при туберкулёзе животных основным звеном в проведении профилактических и оздоровительных мероприятий является диагностика болезни. Применяемые методы диагностики сложные, трудоёмкие, длительные и не позволяют в короткие сроки поставить точный диагноз. Лабораторная диагностика отличается длительностью и относительно низкой эффективностью.
Основными методами диагностики туберкулёза животных в настоящее время являются аллергический, патологоанатомический и бактериологический, так как результаты этих исследований предопределяют окончательный эпизоотологический статус исследуемого поголовья животных, а также в целом фермы и хозяйства. Заболевание туберкулёзом считается установленным, если результаты аллергических исследований подтверждаются данными патологоанатомической экспертизы, а при отсутствии характерных видимых изменений – положительными результатами бактериологического исследования. При проведении бактериологических исследований основным звеном и обоснованием установления диагноза на туберкулёз животных является биологическая проба.
Следует указать, что биологический метод исследования используется с момента открытия Р. Кохом возбудителя туберкулёза. Так, после того, как он обнаружил под объективом микроскопа эти красивого оттенка, крохотные, слегка изогнутые палочки, необходимо было доказать, что они действительно являются возбудителем туберкулёза и экспериментально подтвердить, что только они могут вызвать процесс развития болезни в живом организме. По глубокому убеждению Коха, здоровые люди заболевали туберкулёзом, вдыхая воздух, насыщенный микробами, которые выделялись из высохшей мокроты больного человека. Чтобы подтвердить эту теорию, необходимо было экспериментально заразить здоровых животных таким же путём, каким заражаются и люди. Для проведения такого эксперимента был построен закрытый со всех сторон ящик, в который воздух проходил только через трубку. В этом ящике Кох заражал морских свинок, кроликов и мышей, нагнетая специальными мехами через трубку воздух, наполненный живыми микобактериями туберкулёза. Через месяц ящик был заполнен трупами павших животных. После вскрытия трупов Р. Кох убедился, что все погибли именно от туберкулёза, и написал свою работу «Об этиологии туберкулёза». 24 марта 1882 года в Берлинском обществе физиологов он доложил свою потрясшую весь мир работу об открытии им возбудителя болезни (А.Х. Найманов, М.И. Гулюкин, 2014).
Биологический метод исследования не потерял своего значения и в настоящее время. Так, многие авторы считают биопробу наиболее достоверным методом диагностики туберкулёза животных. Считается, что биопроба даёт положительные результаты у морских свинок при наличии в инъецируемом материале пяти – шести микобактерий (А.П. Аликаева, 1950; Р.О. Драбкина, 1963; Е.А. Финкель и соавт., 1976, 1977; А.И. Кузин, 1982; М.А. Сафин и соавт., 1985; М.Т. Клименко и соавт., 1987; К.К. Ашимова, 1991; С.Ю. Быкова, 1994; А.Д. Панкратова, 2003; Ю.И. Смолянинов и соавт., 2001, 2004; А.С. Донченко и соавт., 2004; Н.С. Боганец, 2006; Р.А. Нуратинов и соавт., 2009; П.В. Бушмелева, 2011; А.Х. Найманов и соавт., 2014).
При постановке биологической пробы изучали различные методы заражения лабораторных животных: алиментарный, подкожный, внутримышечный, интратороксальный, интраторакальный, внутрибрюшинный, конъюнктивальный, интратестикулярный, интраназальный, внутрисердечный, интрацеребральный, в оболочки глаза, внутрикожный и так далее.
В ветеринарной практике для постановки биологической пробы на морских свинках чаще используют подкожный метод введения патологического материала. Этот же метод является основным при определении вирулентности возбудителя туберкулёза.
При работе с кроликами наиболее приемлемым считают внутривенный способ заражения. В основном этот метод используют при определении вида возбудителя туберкулёза.
Е.А. Финкель, Л.В. Михайлова (1976) указывали, что морские свинки отличаются чрезвычайной чувствительностью к заражению микобактериями туберкулёза. У морских свинок можно воспроизвести туберкулёз при любом способе заражения микобактериями бычьего или человеческого видов. Так, при любом методе заражения у морских свинок развивается генерализованный процесс туберкулёза, сопровождающийся гибелью животного. К микобактериям птичьего вида морские свинки менее чувствительны.
Кролики высокочувствительны к M. bovis и менее чувствительны к M. tuberculosis.
Туберкулиновый шок у морской свинки
В историческом плане известно, что уже после открытия туберкулина (1890) Р. Кох установил, что здоровые морские свинки не чувствительны к значительным дозам туберкулина. Больные туберкулёзом морские свинки, наоборот, очень характерно реагируют даже на небольшие дозы туберкулина. Большие дозы препарата могут вызвать гибель больных животных.
Л.А. Зильбер (1948) определила, что при подкожном введении в дозе 0,2 – 0,5 мл альт-туберкулин убивает заражённую морскую свинку в течение 24 –48 часов. Внутрибрюшинное введение препарата в дозе более 0,1 мл вызывает гибель заражённого животного, а здоровые особи легко переносят введение туберкулина даже в дозе 10,0 мл. Интрацеребральное введение туберкулина для больных туберкулёзом смертельно в дозе 0,00001 мл, а для здоровых – только в дозе 3,0 – 5,0 мл.
Р.О. Драбкина, Т.С. Гинсбург (1956), Е.А. Финкель, Л.В. Михайлова, (1976) для воспроизведения туберкулинового шока у морских свинок предложили следующую методику заражения. Морских свинок заражают подкожно культурой M. tuberculosis в дозе 0,01 мг. Через 30 – 40 дней после заражения, на высоте развития аллергической реактивности, животным вводят максимальную смертельную дозу туберкулина, определённую в предварительных опытах. Через 18 – 24 часа после введения туберкулина морские свинки погибают при явлениях туберкулинового шока.
Лабораторная модель воспроизведения туберкулёза животных
Возможность воспроизведения туберкулёза у лабораторных животных определяется различной видовой резистентностью этих особей к туберкулёзу и зависит от применяемого для заражения вида возбудителя вирулентной культуры и количества введённых микобактерий. Для экспериментального воспроизведения туберкулёза чаще всего используют морских свинок, так как они очень чувствительны к заражению туберкулёзом и, на них можно воспроизвести экспериментальное заболевание, вызванное микобактериями бычьего и человеческого видов при любом способе заражения.
В соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулёза животных» (2002) метод биологической пробы применяют для обнаружения патогенных видов возбудителя туберкулёза в исследуемом биоматериале и в целях определения видовой принадлежности культур микобактерий по патогенным свойствам для лабораторных животных.
Выявление возбудителя в биологическом материале проводят параллельно с культуральным исследованием, используя суспензию патматериала для посева на питательные среды и для введения трём морским свинкам.
Определение видовой принадлежности микобактерий проводят путём введения первичных культур микобактерий трём морским свинкам, трём кроликам и трём курам.
Лабораторных животных предварительно проверяют аллергическим методом с туберкулином. Морских свинок и кроликов исследуют ППД-туберкулином для млекопитающих, кур – ППД-туберкулином для птиц.
Биопробу проводят на лабораторных животных, не реагирующих на введение туберкулина.
Постановка биопробы на морских свинках для выявления туберкулёза в исследуемом биологическом материале
Биопробу проводят с патматериалом от каждого животного в отдельности, допускается составлять общую пробу не более, чем от двух животных одного стада. Считается, что этот метод даёт положительные результаты при наличии в инъецируемом материале даже единичных микобактерий туберкулёза.
Для постановки биопробы берут трёх морских свинок массой 300 – 500 г. Взвесь патматериала, использованного для посева на питательные среды и нейтрализованного 10 %-ым стерильным водным раствором двууглекислой соды до получения рН 7,0 – 7,2, отстаивают до оседания крупных частиц. Образовавшуюся надосадочную суспензию в дозе 1,0 – 2,0 мл вводят каждой морской свинке подкожно в область паха. При развитии туберкулёзного процесса у морских свинок через 14 – 28 суток в месте инъекции наблюдают увеличение и уплотнение регионарного лимфатического узла, уплотнение кожи, затем образование язвы. Морские свинки, как правило, прогрессивно худеют, тем не менее, у некоторых морских свинок туберкулёзный процесс может протекать без каких-либо клинических признаков болезни. За животными ведут наблюдение в течение трёх месяцев. При гибели морских свинок во время срока наблюдения проводят вскрытие трупов и патологоанатомическое исследование. При отсутствии падежа особей подвергают эвтаназии через три месяца после заражения и также проводят патологоанатомическое исследование.
Постановка биопробы для определения видовой принадлежности культур возбудителя туберкулёза
Для определения вида возбудителя, выделенного при культуральном исследовании, заражают трёх морских свинок, трёх кроликов и при необходимости трёх кур. Биопробу ставят отдельно с каждой культурой. Заражение проводят трёх- или четырёхнедельной культурой. Морских свинок заражают подкожно в область паха, кроликов – внутривенно в краевую вену уха, кур – внутривенно в подкрыльцовую вену или внутримышечно в область грудины в дозах по 1,0 мг микобактерий, суспендированных в 1,0 мл физиологического раствора. За животными ведут наблюдение в течение трёх месяцев. При гибели особей в течение срока наблюдения проводят вскрытие трупов. При отсутствии падежа животных подвергают эвтаназии через три месяца после заражения.
Определение вида возбудителя проводят на основании патологоанатомических изменений у заражённых животных.
M. bovis вызывает у морских свинок и кроликов генерализованный туберкулёз в течение 20 – 90 суток после введения культуры. У морских свинок в регионарных к месту введения паховых лимфоузлах обнаруживают казеозные очаги. Аналогично поражаются и другие лимфатические узлы. Селезёнка и печень увеличиваются в объёме, становятся плотными, с серо-белыми или серо-жёлтыми мелкими сливающимися узелками. В лёгких также обнаруживают множественные серо-белые очажки.
У кроликов резко увеличиваются лёгкие, в них обнаруживают множественные серо-белые очажки, часто с некрозом. В печени и селезёнке очажки поражения часто наблюдаются в виде отдельных небольших узелков. В почках могут развиваться очаговые поражения.
M. tuberculosis у морских свинок вызывает генерализованный туберкулёз, а у кроликов не вызывает такого прогрессирующего процесса. У кроликов обнаруживают единичные очажки в лёгких, редко в почках, часто поражения отсутствуют.
M. avium у морских свинок, как правило, вызывает только абсцесс в месте введения культуры и увеличение регионарного пахового лимфатического узла. У кроликов вызывает сепсис, который характеризуется резким увеличением селезёнки и гибелью животных в течение 10 – 30 суток. Куры погибают в течение 30 суток, иногда выживают до двух-трёх месяцев. У погибших птиц на вскрытии отмечают резкое увеличение селезёнки и печени. При микроскопии обнаруживают обилие кислотоустойчивых микобактерий. У убитых через три месяца кур находят множественные серо-белые бугорки в печени и селезёнке, а в окрашенных по Циль-Нильсену мазках из органов – микобактерии туберкулёза.
M. bovis и M. tuberculosis при внутривенном заражении кур не вызывают у них заболевания и каких-либо изменений в органах.
Резюмируя указанное, принадлежность микобактерий туберкулёза к тому или другому виду определяют по следующим данным: при генерализованном процессе туберкулёза у морских свинок и кроликов – M. bovis; при отсутствии поражений или наличии единичных типичных очажков в лёгких у кроликов и генерализованном процессе у морских свинок – M. tuberculosis; при наличии поражений у кур и септического процесса у кроликов – M. avium.
В последние годы в ветеринарной практике некоторые исследователи предлагают использовать ускоренный способ проведения биологической пробы на морских свинках.
Н.С. Боганец, А.Д. Панкратова, В.Ф. Бордюч, Н.Н. Кошеев (2001), А.Д. Панкратова (2003), Ю.И. Смолянинов, Н.С. Боганец, А.Д. Панкратова (2004), Н.С. Боганец (2006), Н.С. Боганец, Н.А. Свириденко, Л.Т. Аппельганс, А.Д. Панкратова (2011) установили, что организм морских свинок индифферентен к ППД-туберкулину для млекопитающих в дозах до 5,0 мл стандартного разведения при внутрибрюшинном введении. Летальная доза туберкулина для них составляет 15,0 – 20,0 мл. Внутрибрюшинное введение ППД-туберкулина для млекопитающих заражённым морским свинкам в дозе 1,0 мл стандартного разведения вызывает анафилактический шок с последующей гибелью в течение 16 – 25 часов. Оптимальный срок внутрибрюшинного введения ППД-туберкулина для млекопитающих, при котором воспроизводится анафилактический шок, у всех заражённых морских свинок составляет 30 дней.
Для сокращения сроков постановки биологической пробы авторы предлагают ускоренный способ проведения биологической пробы с конечной целью воспроизвести анафилактический туберкулиновый шок у заражённых животных.
В целях усовершенствования биологической пробы некоторые исследователи предлагают использовать новые экспериментальные модели для воспроизведения туберкулёза.
П.В. Бушмелёва (2011) установила, что перепела восприимчивы к заражению туберкулёзом птичьего вида, внутривенное введение 41-суточным перепелам суспензии культуры M. avium вызывает выраженные изменения во внутренних органах. Карликовые кролики более чувствительны к возбудителю M. bovis, чем кролики породы советская шиншилла. Автор предлагает усовершенствованный метод биологической пробы с использованием перепелов и карликовых кроликов для идентификации культур M. avium и M. bovis.
Другие исследователи предлагают использовать морских свинок в качестве лабораторной модели для выявления туберкулёзной инфекции при сравнительных исследованиях микобактериальных аллергенов.
Ю.М. Мясоедов, А.Х. Найманов (2015) установили, что сенсибилизированные M. bovis (штамм БЦЖ) морские свинки являются оптимальной лабораторной моделью для воспроизведения повышенной чувствительности замедленного типа (ПЧЗТ) при сравнительных исследованиях микобактериальных аллергенов. Эта модель характеризуется высокой степенью сходства с моделью, предполагающей использование вирулентных M. bovis (штамм 8).
Вариант лабораторной модели выявления туберкулёзной инфекции, предполагающий внутрикожное введение морским свинкам M. bovis (штамм БЦЖ), характеризуется безопасностью, оптимальной интенсивностью развития кожной реакции и является наиболее приемлемым для развития ПЧЗТ. Авторы считают, что внутрикожное введение авирулентных M. bovis (штамм БЦЖ) является оптимальным для сравнительного изучения микобактериальных аллергенов и позволяет проводить оценку развития ПЧЗТ в организме морских свинок.
Ю.М. Мясоедов, В.М. Безгин, В.Е. Козлов, А.Х. Найманов (2016) провели перерасчёт ранее используемых при диагностике туберкулёза животных туберкулиновых единиц (ТЕ) ППД-туберкулина для млекопитающих в международные единицы (МЕ) и оценку эффективности диагностической дозы ППД-туберкулина для млекопитающих при постановке биопробы на морских свинках.
Авторы установили, что используемые ранее при постановке биопробы 25 ТЕ (Международный стандарт PPD-S) соответствуют 5 МЕ (PPD-bovine).
На инфицированных M. bovis (штамм БЦЖ) морских свинках показано, что применение ППД-туберкулина для млекопитающих с биологической активностью от 600 до 15000 МЕ/см3 и стандартной схемы разведения позволяет получить дозировку 3,3 МЕ, 5,0 МЕ и 7,5 МЕ, которые выявляют до 100 % инфицированных морских свинок.
Представленный обзор литературных данных показывает, что биологический метод исследования при туберкулёзе применяется с момента открытия возбудителя и является одним из старых, классических методов воспроизведения заболевания на лабораторных животных. По мнению А.Х. Найманова, М.И. Гулюкина (2014), этот метод сохраняет свою актуальность и на современном этапе борьбы с туберкулёзом животных как наиболее точный и надёжный метод постановки диагноза. Кроме того, метод обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Недостатком биологической пробы является длительность, трудоёмкость, высокая стоимость исследований. Тем не менее, и в настоящее время биологическая проба остаётся единственным и точным методом подтверждения диагноза на туберкулёз.
Заключение
На современном этапе борьбы с туберкулёзом животных диагностика должна быть комплексной, с использованием эпизоотологического анализа, аллергических, патологоанатомических и лабораторных методов диагностики. В конечном итоге, в сложных случаях при установлении диагноза на туберкулёз и сомнительных результатах патологоанатомического исследования биологическая проба на лабораторных животных является наиболее точным и надёжным методом подтверждения диагноза.
Литература
1 Ашимова, К.К. Совершенствование биологической пробы при диагностике туберкулёза крупного рогатого скота: Автореф. дисс. к.в.н. / К.К. Ашимова. – Москва, 1991. – 27 с.
2 Боганец, Н.С. Ускоренная биопроба на морских свинках в диагностике туберкулёза / Н.С. Боганец, А.Д. Панкратова, В.Ф. Бордюч, Н.Н. Кошеев // Сб. научн. Тр. «Инфекционная патология животных». – Омск: ВНИБТЖ. – 2001. – С. 216-218.
3 Боганец, Н.С. Бактериологическая диагностика туберкулёза животных и её усовершенствование: Автореф. дисс. д.в.н. / Н.С. Боганец. – Омск, 2006. – 38 с.
4 Боганец, Н.С. Комиссионное испытание метода ускоренной постановки биологической пробы на туберкулёз / Н.С. Боганец, Н.А. Свириденко, Л.Т. Аппельганс, А.Д. Панкратова // Матер. междунар. научн.-практ. конф. «Инфекционная патология животных». – Омск. – 2011. – С. 92-96.
5 Бушмелёва, П.В. Новые экспериментальные модели для биологической пробы при диагностике туберкулёза сельскохозяйственных животных: Автореф. дисс. к.б.н.. – Новосибирск, 2011. – 20 с.
6 Быкова, С.Ю. Течение туберкулёза у морских свинок на фоне инфицирования атипичными микобактериями: Автореф. дисс. к.в.н. / С.Ю. Быкова. 1994. – 23 с.
7 Донченко, А.С. Диагностика туберкулёза крупного рогатого скота / А.С. Донченко, Н.П. Овдиенко, Н.А. Донченко // Новосибирск, 2004. – 308 с.
8 Клименко, М.Т. Результаты биологического и культурального методов исследования при диагностике туберкулёза / М.Т. Клименко, Т.С. Гинсбург // Проблемы туберкулёза. – 1987. – № 8. – С. 45-47.
9 Мясоедов, Ю.М. Разработка лабораторной модели в целях выявления ПЧЗТ при исследовании микобактериальных аллергенов / Ю.М. Мясоедов, А.Х. Найманов // Ветеринария и кормление. – 2015. – № 2. – С. 28-31.
10 Мясоедов, Ю.М. Оптимальная диагностическая доза ППД-туберкулина для млекопитающих в МЕ при биологической пробе на лабораторных животных / Ю.М. Мясоедов, В.М. Безгин, В.Е. Козлов, А.Х. Найманов // Ветеринария и кормление. – 2016. — № 6. – С. 31-33.
11 Найманов, А.Х. Микобактериальные инфекции крупного рогатого скота (туберкулёз, паратуберкулёз) / А.Х. Найманов, М.И. Гулюкин // М.: ЗооветКнига. – 2014. – 235 с.
12 Нуратинов, Р.А. Туберкулёз / Р.А. Нуратинов, М.Г. Газимагомедов // Махачкала. – 2009. – 336 с.
13 Панкратова, А.Д. Метод ускоренной постановки биологической пробы на морских свинках в диагностике туберкулёза животных: Автореф. дисс. к.в.н. / А.Д. Панкратова. – Новосибирск, 2003. – 17 с.
14 Смолянинов, Ю.И. Метод ускоренной постановки биологической пробы на морских свинках в диагностике туберкулёза животных / Ю.И. Смолянинов, Н.С. Боганец, А.Д. Панкратова // Ветеринарная патология. – 2004. – № 1-2 (9). – С. 115-118.
15 Финкель, Е.А. Биологический метод исследования при туберкулёзе / Е.А. Финкель, Л.В. Михайлова // Фрунзе. – 1976. – 156 с.
