Сравнительное изучение аллергенов для дифференциальной диагностики туберкулеза
Али Найманов
А.Х. Найманов, доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий лабораторией микобактериозов
Г.И. Устинова, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии и молекулярной биологии
Н.Г. Толстенко, кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник лаборатории микобактериозов
Е.П. Вангели, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории микобактериозов
О.Д. Кучерук, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник лаборатории биохимии и молекулярной биологии
В.М. Калмыков, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник лаборатории микобактериозов
ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ)
109428, Российская Федерация, Москва, Рязанский проспект, 24, к.1
РЕЗЮМЕ
В целях совершенствования симультанной туберкулиновой пробы для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин, изготовлены лабораторные серии двух комплексных аллергенов из нетуберкулезных микобактерий (НТМБ) КАМ-2 и КАМ-3. КАМ-2 изготовлен из наиболее часто выделяемых от реагирующих животных и обладающих наибольшими сенсибилизирующими свойствами атипичных микобактерий 2, 3 и 4 групп по классификации Раньена (M. scrofulaceum – 2 гр., M. intracellulare – 3 гр., M. smegmatis и M. fortuitum – 4 гр.). КАМ-3 изготовлен из 3-х основных видов микобактерий, входящих в состав ППД туберкулина для птиц, КАМ и КАМ-2 (M. scrofulaceum – 2 гр., M. avium – 3 гр. и M. fortuitum – 4 гр.).
При сравнительном изучении диагностической ценности лабораторных серий КАМ-2 и КАМ-3 с биофабричными КАМ и ППД туберкулином для птиц на сенсибилизированных различными видами микобактерий морских свинках, установлено, что КАМ-3 по биологической активности и специфичности превосходит все испытанные аллергены.
Ключевые слова: туберкулез, атипичные микобактерии, морские свинки, сенсибилизация, неспецифические реакции, ППД туберкулин для млекопитающих, ППД туберкулин для птиц, КАМ, КАМ-2, КАМ-3.
Основным методом диагностики туберкулеза крупного рогатого скота является внутрикожная проба с ППД туберкулином для млекопитающих. Одной из главных проблем при исследовании этой пробой является выявление неспецифических реакций на туберкулин. Причиной выявления этих реакций считается сенсибилизация животных близкородственными нетуберкулезными (атипичными) микобактериями.
В соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулеза животных», утвержденного Департаментом ветеринарии МСХ РФ от 18.11.2002 г., для дифференциации неспецифических реакций применяется симультанная проба с ППД для млекопитающих и КАМ или симультанная проба с ППД для млекопитающих и ППД для птиц. В доступной литературе мало данных об эффективности этих проб, а имеющие данные противоречивы. Так, одни авторы считают, что эти пробы обладают одинаковой эффективностью, другие предпочитают симультанную пробу с ППД для птиц, третьи предпочитают симультанную пробу с КАМ. Проведенные сотрудниками ВИЭВ и ВГНКИ исследования показали некоторое преимущество симультанной пробы с КАМ. А.Н. Шаров (1989), Н.П. Овдиенко (1990), Н.П. Овдиенко и соавт. (1995), А.Х. Найманов (1993), А.Х. Найманов и соавт. (2005, 2006, 2009), Н.Р. Хасанов (2001), Н.П. Помыканов (2005) указывают, что в благополучных хозяйствах, где установлена сенсибилизация животных атипичными микобактериями, симультанная проба с КАМ обладает большей диагностической значимостью, чем с ППД для птиц.
В связи с тем, что в последние годы в благополучных хозяйствах Российской Федерации в основном устанавливают сенсибилизацию крупного рогатого скота атипичными микобактериями, а сенсибилизация M. avium выявляется редко, считается, что для дифференциации неспецифических реакций более предпочтительно применять симультанную пробу с ППД для млекопитающих и КАМ.
Главным недостатком симультанной туберкулиновой пробы является недостаточная её эффективность. Так, по сообщениям некоторых авторов из различных регионов РФ, симультанная проба с ППД для млекопитающих и КАМ позволяет дифференцировать неспецифические реакции от 0 до 77% случаев. Кроме того, проба «является групповой и дает возможность ориентироваться в ситуации по туберкулёзу лишь в целом по стаду или группе (не менее 6 голов) исследуемых животных».
Комплексный аллерген из атипичных микобактерий (КАМ) внедрил в производство А.Н. Шаров. «Наставление по проведению симультанной аллергической пробы с применением туберкулина и КАМ при диагностике туберкулеза животных» было утверждено ГУВ МСХ СССР 27.11.1978 г. Впоследствии это наставление было пересмотрено и утверждено ГУВ МСХ СССР 04.07.1980 г.
Первоначально КАМ готовили из 3-х видов атипичных микобактерий: M. kansasii (1 гр.); M. scrofulaceum (2 гр.); M. intracellulare (3 гр. по Раньону). В дальнейшем, в связи с тем, что M. kansasii на территории нашей страны не выделяется, его исключили из состава КАМ. В настоящее время КАМ готовят из двух видов атипичных микобактерий: M. scrofulaceum и M. intracellulare.
А.Н. Шаров (1989) в более поздних работах указывал, с учетом того, что сенсибилизацию организма крупного рогатого скота в разных регионах нашей страны вызывают атипичные микобактерии 2, 3 и 4 групп по Раньону, КАМ должен изготавливаться из микобактерий 2, 3 и 4 групп. В дифференциальной диагностике туберкулеза симультанной пробой основное значение имеет не количество реагирующих животных, а интенсивность проявления аллергических реакций на тот или иной аллерген. В симультанной пробе наряду с ППД для млекопитающих необходимо применять аллерген, изготовленный по методике производства туберкулина, что обеспечивает единообразие химического состава аллергенов, необходимое для развития качественно равноценных реакций. Аллергены должны применяться в сопоставимых дозах и стандартизированы по биологической активности с целью исключения возможности проявления превосходства одного из них по причине количественного различия.
С учетом указанного, совершенствование аллергенов и сравнительное их изучение в симультанной туберкулиновой пробе является самой актуальной проблемой на современном этапе борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота.
Материалы и методы
Исследования проводили в соответствии «Наставления по диагностике туберкулеза животных от 2002». Работу выполняли на базе лабораторий микобактериозов и биохимии и молекулярной биологии в Вышневолоцком филиале ВИЭВ о. Лисий. Исследования проводили с использованием бактериологических, аллергических и биохимических методов.
В работе использовали:
— ППД туберкулин для млекопитающих – биофабричный аллерген для диагностики туберкулеза у животных. Производится Курской биофабрикой из M. bovis шт. AN-5;
— ППД туберкулин для птиц – аллерген для диагностики туберкулеза птиц, используется и для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота и свиней в симультанной пробе. Производится Курской биофабрикой из M. avium шт. 2282;
— КАМ – комплексный аллерген из атипичных микобактерий для дифференциации неспецифических реакций. Производится Курской биофабрикой из атипичных микобактерий 2 и 3 группы по классификации Раньона (M. scrofulaceum – 2 гр., M. intracellulare – 3 гр.);
— КАМ-2 – опытная лабораторная серия комплексного аллергена из атипичных микобактерий, изготовленный из 4-х видов наиболее часто выделяемых на территории РФ и обладающих сенсибилизирующими свойствами атипичных микобактерий 2, 3 и 4 группы по классификации Раньона (M. scrofulaceum – 2 гр., M. intracellulare – 3 гр., M. fortuitum и M. smegmatis – 4 гр.).
— КАМ-3 – опытная лабораторная серия комплексного аллергена из микобактерий. Изготовлен из 3-х основных видов микобактерий, входящих в состав: ППД туберкулина для птиц (M. avium шт.2282 — 3 гр.), КАМ (M. scrofulaceum — 2 гр.), КАМ-2 (M. fortuitum — 4 гр.).
Активность и специфичность опытных лабораторных серий КАМ-2 и КАМ-3 ВИЭВ изучали в сравнении с биофабричными аналогами в Вышневолоцком филиале ВИЭВ на 23 сенсибилизированных различными видами микобактерий (M. avium, M. intracellularae, M. scrofulaceum, M. fortuitum, M. bovis БЦЖ) морских свинках.
Результаты исследований
В лаборатории микобактериозов была выращена бакмасса культур различных видов микобактерий: M. bovis БЦЖ, M. avium, M. scrofulaceum, M. intracellulare, M. smegmatis и M. fortuitum. В лаборатории биохимии и молекулярной биологии из убитых автоклавированием культур изготовлены опытные лабораторные серии КАМ-2 и КАМ-3.
В Вышневолоцком отделе ВИЭВ провели сенсибилизацию 25 морских свинок взвесью культур различных видов микобактерий: M. bovis BCG – 5 голов, M. avium – 5 голов, M. intracellulare – 5 голов, M. scrofulaceum – 5 голов и M. fortuitum – 5 голов. Сенсибилизацию проводили двукратно с интервалом 14 дней между первым и вторым подкожным введением суспензии взвеси микобактерий на физиологическом растворе, в дозе 5 мг/мл.
Через месяц на сенсибилизированных морских свинках провели сравнительное изучение диагностической ценности опытных лабораторных серий аллергенов КАМ-2 и КАМ-3 в сравнении с биофабричными аналогами. При этом сенсибилизированных морских свинок исследовали: ППД туберкулином для млекопитающих, ППД туберкулином для птиц, КАМ, КАМ-2 и КАМ-3. Каждой морской свинке вводили внутрикожно в область брюшка, справа и слева, 5 аллергенов в соответствующей дозе. Учет результатов внутрикожной пробы проводили через 24 и 48 часов после введения аллергенов. Реагирующими считали животных при выявлении характерной припухлости и покраснения в месте внутрикожного введения аллергенов диаметром на 5 мм и больше. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1.
Анализ данных таблицы 1 показывает, что из 5 сенсибилизированных M. bovis БЦЖ морских свинок – 2 пали в процессе опыта, остальные 3 реагировали с реакцией 8-20 мм на ППД туберкулин для млекопитающих, на ППД для птиц реагировала одна морская свинка с реакцией 5,5 мм, на КАМ реагировала одна морская свинка с реакцией 5,5 мм. На КАМ-2 и КАМ-3 сенсибилизированные M. bovis БЦЖ морские свинки не реагировали.
Из 5 сенсибилизированных M. avium морских свинок – 2 пали, а оставшиеся 3 дали положительные реакции на ППД для птиц, КАМ, КАМ-2 и КАМ-3. Причем реакции на КАМ-3 были более выражены, чем на другие аллергены (от 13,5 до 21,0 мм). На ППД для млекопитающих сенсибилизированные M. avium морские свинки не реагировали.
Из 5 сенсибилизированных M. intracellulare морских свинок, 2 –реагировали на ППД для млекопитающих, 3 – на ППД для птиц, 3 – на КАМ, все 5 реагировали положительно на КАМ-2 и КАМ-3. Причем реакции на КАМ-3 были выражены более интенсивно, чем на другие аллергены (от 10,0 до 17,0 мм).
Из 5 сенсибилизированных M. scrofulaceum морских свинок — одна пала, 4 реагировали на ППД для млекопитающих, 1 – на ППД для птиц, 3 – на КАМ, а на КАМ-2 и КАМ-3 реагировали все 4 морские свинки. Причем на КАМ-3 реакции были с наибольшей интенсивностью (от 13,0 до 19,5 мм).
Из 5 сенсибилизированных M. fortuitum морских свинок – одна пала, 2 реагировали на ППД для млекопитающих, 1 – на ППД для птиц, 2 – на КАМ, все 4 реагировали на КАМ-2 и КАМ-3. Причем на КАМ-3 реагировали с наибольшей интенсивностью реакций (от 12,0 до 14,0 мм).
Анализ результатов проведенных исследований показывает, что по активности и специфичности КАМ-3 превосходит все испытанные аллергены. Так, все сенсибилизированные M. bovis БЦЖ морские свинки не реагировали на КАМ-2 и КАМ-3. Морские свинки, сенсибилизированные M. avium и атипичными микобактериями, реагировали на ППД для птиц, КАМ, КАМ-2 и КАМ-3. Причем, интенсивность проявления аллергических реакций была в большей степени выражена на КАМ-3 (от 10,0 до 21,0 мм). Полученные результаты исследований доказывают, что КАМ-3 более активный и специфичный аллерген для дифференциации неспецифических реакций на туберкулин.
В настоящее время проводятся сравнительные испытания диагностической ценности биофабричного КАМ и опытных лабораторных серий КАМ-2 и КАМ-3 ВИЭВ в благополучных по туберкулезу хозяйствах РФ.
Выводы:
1. В связи с широким распространение во внешней среде и выделением от реагирующих животных с неспецифическими реакциями атипичных микобактерий, для дифференциации неспецифических реакций целесообразно использование симультанной пробы с ППД для млекопитающих и КАМ.
2. В связи с тем, что сенсибилизацию организма крупного рогатого скота вызывают НТМБ 2, 3 и 4 гр., следует готовить комплексный аллерген из микобактерий 2, 3 и 4 групп по классификации Раньона.
3. На сенсибилизированных различными видами НТМБ морских свинках КАМ-3 по активности и специфичности превосходит ППД туберкулин для птиц, КАМ и КАМ-2.
Литература:
1. Овдиенко Н.П. Эпизоотология и диагностика туберкулеза крупного рогатого скота в условиях интенсификации животноводства: дисс. докт. вет. наук – Москва, 1990. — 440 с.
2. Овдиенко Н.П., Найманов А.Х., Помыканов Н.П. и др. Совершенствование симультанной пробы с ППД туберкулином для млекопитающих и КАМ // Тезисы докл. науч.-практ. конф. «Основные научные исследования по проблеме туберкулеза и бруцеллеза с.-х. животных». — Новосибирск, 1995. — С. 44.
3. Помыканов Н.П. Совершенствование диагностики туберкулеза крупногорогатого скота в индивидуальных хозяйствах: автореф. дисс. канд. вет. наук. – Москва, 2005. – 23 с.
4. Найманов А.Х. Аллергическая диагностика микобактериальных инфекций крупного рогатого скота: автореф. дисс. докт. вет. наук. – Москва, 1993. – 29 с.
5. Найманов А.Х., Овдиенко Н.П., Помыканов Н.П. и др. Сравнительное изучение симультанной пробы с ППД туберкулином для млекопитающих и для птиц с симультанной пробой с ППД туберкулином для млекопитающих и КАМ // Материалы междунар. науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных». – Москва, 2006. – С. 303-306.
6. Хасанов Н.Р. Совершенствование Дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота: дисс. канд. вет. наук. – Душанбе, 2001. – 105 с.
7. Шаров А.Н. Аллергическая диагностика туберкулеза животных: повышение ее эффективности: дисс. докт. вет. наук. – Москва, 1989. – 373 с.
