Морская свинка – лабораторная модель при туберкулёзе животных
Али Найманов
А. Х. Найманов
доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий
лабораторией микобактериозов ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН
Москва, Российская Федерация
В.М. Калмыков
кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник
лаборатории микобактериозов ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН
Москва, Российская Федерация
М.С. Калмыкова
кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры радиобиологии и вирусологии имени академиков А.Д. Белова и В.Н. Сюрина,
ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К. И. Скрябина
Москва, Российская Федерация
Н.Г. Толстенко
кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник
лаборатории микобактериозов ФГБНУ ВИЭВ
Москва, Российская Федерация
Аннотация
В эксперименте с заражёнными туберкулёзом животными установлено, что наиболее чувствительными и восприимчивыми к заражению M. bovis являются морские свинки. При контакте с заражёнными M. bovis, M. tuberculosis и M. avium козами, морские свинки заразились туберкулёзом воздушно-капельным (аэрогенным) путём от заражённых M. bovis коз, т.е. естественным путём заражения здоровых животных от больных.
Ключевые слова: туберкулёз, козы, морские свинки, M.bovis, M.tuberculosis, M. avium, ППД-туберкулин для млекопитающих, ПЦР, биопроба, лабораторная модель.
Процесс распространения инфекции среди животных принято называть эпизоотическим процессом, который представляет собой цепь последовательных заражений здоровых животных от других – заражённых животных. Эпизоотический процесс может продолжаться бесконечно долго, если существуют и взаимодействуют все три его компонента: источник возбудителя инфекции, механизм передачи и восприимчивые животные.
Интенсивность проявления эпизоотического процесса зависит от взаимодействия биологических, природных и экономических факторов, т.е. от резистентности организма животных, путей проникновения и вирулентности возбудителя, а также условий кормления и содержания (И.А. Бакулов, 1979).
Основными методами диагностики туберкулёза животных являются: аллергический, патологоанатомический и бактериологический, т.к. результаты этих исследований предопределяют окончательный эпизоотический статус исследуемого поголовья животных. Заболевание туберкулёзом считается установленным, если результаты аллергических исследований подтверждаются данными патологоанатомической экспертизы, а при отсутствии характерных для туберкулёза изменений – положительными результатами бактериологического исследования. При проведении бактериологических исследований основным обоснованием для установления диагноза на туберкулёз является положительная биологическая проба.
Биологический метод исследования используется с момента открытия Р. Кохом возбудителя туберкулёза.
Этот метод не потерял своего значения и в настоящее время. Многие авторы считают биопробу наиболее достоверным методом диагностики туберкулёза животных. (А.П. Аликаева, 1950; Н.П. Овдиенко и соавт., 1990; Ю.А Смолянинов и соавт., 2001, 2004; А.С. Донченко и соавт., 2004; Н.С. Боганец, 2006; Н.Г. Толстенко, 2006; Р.А. Нуратинов и соавт., 2009; П.В. Бушмелева, 2011; А.Х. Найманов и соавт., 2014, 2018).
При постановке биологической пробы различные авторы изучали разные методы заражения лабораторных животных. В ветеринарной практике для постановки биологической пробы на морских свинках чаще используют подкожный метод. Этот же метод является основным при определении вирулентности возбудителя туберкулёза.
Е.А. Финкель и соавт. (1976) указывают, что существует и аэрозольный метод заражения животных туберкулёзом, при этом морских свинок помещают в специальные камеры, где и распыляют материал для заражения. Авторы утверждают, что морские свинки чрезвычайно чувствительны к заражению туберкулёзом, поэтому у них можно воспроизвести туберкулёз при любом методе заражения.
А.Х. Найманов и соавт. (2013) установили, что в оздоровленных от туберкулёза стадах крупного рогатого скота, на заключительной стадии оздоровительных мероприятий, от реагирующих животных выделяют культуры M. bovis, обладающие слабой степенью вирулентности, способные вызывать процесс развития туберкулёза только у чувствительных к туберкулёзу морских свинок. При длительном хранении и многократных пересевах на питательные среды лабораторные штаммы M. bovis постепенно теряют вирулентные свойства и обладают остаточной вирулентностью для морских свинок.
В историческом плане известно, что уже после открытия туберкулина (1890) Р. Кох установил, что здоровые морские свинки не чувствительны к значительным дозам туберкулина. Больные туберкулёзом морские свинки, наоборот, очень характерно реагируют даже на небольшие дозы туберкулина. Большие дозы туберкулина могут вызвать гибель больных туберкулёзом животных.
Л.А. Зилберг (1948) определила, что при подкожном введении в дозе 0,2-0,5 мл альтуберкулин убивает заражённую морскую свинку в течение 24-48 часов. Внутрибрюшинное введение в дозе более 0,1 мл вызывает гибель заражённого животного, а здоровые животные легко переносят введение туберкулина даже в дозе 10,0 мл. Интрацеребральное введение туберкулина для больных туберкулёзом смертельно в дозе 0,00001 мл, а для здоровых только в дозе 3,0-5,0 мл.
Р.О. Драбкина и соавт. (1956), Е.А. Финкель, Л.В. Михайлова (1976) для воспроизведения туберкулинового шока у морских свинок предложили морских свинок заражать подкожно M. tuberculosis в дозе 0,01 мг. Через 30-40 дней после заражения, на высоте развития аллергической реактивности, животным вводят максимальную смертельную дозу туберкулина. Через 18-24 часа после введения туберкулина морские свинки погибают при явлениях туберкулинового шока.
Н.С. Боганец и соавт. (2001, 2006, 2011), Ю.И. Смолянинов и соавт. (2003, 2004), А.Д. Панкратова и соавт. (2003) установили, что организм морских свинок индифферентен к ППД-туберкулину для млекопитающих в дозах до 5,0 мл стандартного разведения при внутрибрюшинном введении. Летальная доза туберкулина для них составляет 15,0-20,0 мл. внутрибрюшинное введение ППД-туберкулина для млекопитающих заражённым морским свинкам в дозе 1,0 мл стандартного разведения вызывает анафилактический шок с последующей гибелью в течение 16-25 часов. Оптимальный срок внутрибрюшинного введения ППД-туберкулина для млекопитающих, при котором воспроизводится анафилактический шок, 30 дней. Для сокращения сроков постановки биологической пробы авторы предлагают ускоренный способ с конечной целью воспроизвести анафилактический шок у заражённых животных.
Другие исследователи предлагают использовать морских свинок в качестве лабораторной модели для выявления туберкулёзной инфекции при сравнительных исследованиях микобактериальных аллергенов.
Ю.М. Мясоедов и соавт. (2015) установили, что сенсибилизированные M. bovis морские свинки являются оптимальной лабораторной моделью для воспроизведения повышенной чувствительности замедленного типа (ПЧЗТ) при сравнительных исследованиях микобактериальных аллергенов. Эта модель характеризуется высокой степенью сходства с моделью, предполагающей использование вирулентных M. bovis (штамм 8). Авторы считают, что внутрикожное введение авирулентных M. bovis (штамм БЦЖ) является оптимальным для сравнительного изучения микобактериальных аллергенов и позволяет проводить оценку развития ПЧЗТ в организме морских свинок.
Ю.М. Мясоедов и соавт. (2016) провели перерасчёт ранее используемых при диагностике туберкулёза животных туберкулиновых единиц (ТЕ) ППД-туберкулина для млекопитающих в международные единицы (МЕ) и оценку эффективности диагностической дозы ППД-туберкулина для млекопитающих при постановке биологической пробы на морских свинках. Авторы установили, что используемы ранее при постановке биопробы 25 ТЕ (Международный стандарт PPD-S) соответствуют 5 МЕ (PPD-bovine).
Представленный обзор литературных данных показывает, что биологический метод исследования при туберкулёзе применяется с момента открытия возбудителя, и в настоящее время является одним из классических методов воспроизведения туберкулёза. Этот метод сохраняет свою актуальность и на современном этапе борьбы с туберкулёзом животных как наиболее надёжный метод установления диагноза на туберкулёз, обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Недостатком биологической пробы является длительность, трудоёмкость, высокая стоимость исследований.
Известно, что в естественных условиях животные заражаются туберкулёзом, главным образом, воздушно-капельным путём, особенно при совместном содержании больных и здоровых животных в тёмных, сырых, тесных животноводческих фермах.
В связи с указанным, целью наших исследований было проведение естественного заражения морских свинок от больных туберкулёзом животных при тесном контакте здоровых и больных туберкулёзом животных.
Материалы и методы:
В В.Волоцком филиале ВИЭВ, на экспериментальной базе о. Лисий провели заражение 17 коз в возрасте до одного года. Козы были разделены на пять групп и заражены орально M. bovis, M. tuberculosis и M. avium. Животных содержали в отдельных боксах в течение 9 месяцев.
В боксы, где содержались заражённые животные, были подсажены по три морские свинки, три кролика и три курицы. Кроме того, в боксы с заражёнными M. bovis козами, были поставлены на контакт по заражению две здоровые козы.
Результаты исследований:
Аллергические исследования заражённых коз показали вариабельность проявления реакций в зависимости от времени исследования, места введения и использованного аллергена. Так, на пальпебральное введение ППД-туберкулина для млекопитающих через 21, 55 дней после заражения реагировали все заражённые козы с различной интенсивностью реакций. Кроме того, стали реагировать (с интенсивностью реакции «++») козы, поставленные в бокс к заражённым M.bovis козам.
При дальнейших исследованиях аллергические реакции проявлялись нестабильно: с меньшей интенсивностью или же выпадали, а затем появлялись вновь. Наиболее интенсивно козы реагировали через 266 дней после заражения. Следует отметить, что через 103 дня после заражения у заражённых культурой M.tuberculosis коз и коз, находящихся в контакте с заражёнными M.bovis животными, аллергические реакции проявились с наибольшей интенсивностью.
Животные контрольной группы не реагировали на пальпебральную туберкулиновую пробу на протяжении всего опыта.
Первое ПЦР-исследование биоматериала от коз было проведено через 21 день после заражения. В результате ДНК возбудителя туберкулёза выделена из носовой слизи от козы, заражённой M.tuberculosis. Затем, через 55, 103, 134, 164, 218 и 266 дней во всех случаях получены отрицательные результаты. И только через 296 после заражения были получены единичные положительные результаты.
Таким образом, установлено, что метод ПЦР недостаточно эффективен для прижизненной диагностики туберкулёза у экспериментально заражённых коз. За период исследований нам не удалось определить наиболее информативный биоматериал, исследование которого давало бы возможность установить прижизненный диагноз на туберкулёз. Однократные положительные результаты ПЦР, также как и пальпебральной туберкулиновой пробы, были не стабильными.
Через 296 дней после заражения животные были убиты. При патологоанатомическом осмотре у двух заражённых M.bovis коз и у двух поставленных на контакт коз обнаружены характерные для туберкулёза изменения в лимфатических узлах головы и лёгких. У коз контрольной группы характерных для туберкулёза изменений не обнаружили.
Установлено, что экспериментально заражённые козы являются источником возбудителей туберкулёза, выделяют микобактерии во внешнюю среду.
При патологоанатомическом исследовании лабораторных животных, находившихся в контакте с заражёнными M.bovis козами, характерные для туберкулёза изменения обнаружили у двух морских свинок. ПЦР-исследованием патматериала от лабораторных животных ДНК M.bovis выделена из патматериала от одной морской свинки. Из патматериала от кроликов и кур ДНК возбудителя туберкулёза не выделили.
При патологоанатомическом исследовании лабораторных животных, находившихся в контакте с заражёнными M.tuberculosis козами, характерных для туберкулёза изменений не обнаружили. Культуральным исследованием патматериала от этих лабораторных животных возбудителя туберкулёза не выделили. ПЦР-исследованием патматериала от лабораторных животных ДНК M.tuberculosis выделили от трёх морских свинок. Из патматериала от кроликов и кур ДНК возбудителя туберкулёза не выделили.
При патологоанатомическом исследовании лабораторных животных, находившихся в контакте с заражёнными M.avium козами, характерные для туберкулёза изменения обнаружены у одной из трёх кур, у остальных животных характерных для туберкулёза изменений не обнаружили. Культуральным исследованием из патматериала от двух кур выделили возбудитель туберкулёза. ПЦР-исследованием патматериала от двух кур выделили ДНК M.avium, в остальных случаях получены отрицательные результаты.
На основании представленных результатов исследований можно сделать следующие выводы:
1. Оптимальной лабораторной моделью для воспроизведения туберкулёза животных является морская свинка.
2. Козы чувствительны к экспериментальному заражению M.bovis. При содержании здоровых коз вместе с заражёнными, козы заболевают туберкулёзом и выделяют возбудителя туберкулёза во внешнюю среду.
3. Морские свинки являются наиболее чувствительными к заражению туберкулёзом M. bovis, т.к. они заражаются туберкулёзом при любом методе заражения.
Заключение:
На современном этапе борьбы с туберкулёзом животных оптимальной лабораторной моделью воспроизведения туберкулёза является морская свинка.
Литература
1. Калмыкова, М.С. Применение метода ПЦР при диагностике туберкулёза коз / М.С. Калмыкова, Е.П. Осипова, Н.Г. Толстенко, В.И. Строганов // Ветеринарная патология.- 2006.- №3.- С.149-151.
2. Мясоедов, Ю.М. Разработка лабораторной модели в целях выявления ПЧЗТ при исследовании микобактериальных аллергенов / Ю.М. Мясоедов, А.Х. Найманов // Ветеринария и кормление. – 2015. — № 2. – С. 28-31.
3. Мясоедов, Ю.М. Оптимальная диагностическая доза ППД-туберкулина для млекопитающих в МЕ при биологической пробе на лабораторных животных / Ю.М. Мясоедов, В.М. Безгин, В.Е. Козлов, А.Х. Найманов // Ветеринария и кормление. – 2016. — № 6. – С. 31-33.
4. Найманов, А.Х. Эпизоотический процесс туберкулёза крупного рогатого скота в зависимости от вирулентности M.bovis / А.Х. Найманов, И.В. Солодова, Н.Г. Толстенко, О.В. Якушева // Труды ВИЭВ. – 2003. – т.77. – С. 103-110.
5. Найманов, А.Х. Микобактериальные инфекции крупного рогатого скота (туберкулёз, паратуберкулёз) / А.Х. Найманов, М.И. Гулюкин // М.: Зооветкнига. – 2014. – 235 с.
6. Найманов, А.Х. Туберкулёз животных (Учебники для вузов. Специальная литература) / А.Х.Найманов, В.М. Калмыков // СПб.: Издательство «Лань», 2018. – 504 с.
7. Найманов, А.Х. Воспроизведение туберкулёза на лабораторных животных (биологичесакая проба) / А.Х. Найманов, В.М. Калмыков, М.С. Калмыкова // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. – 2018. — № 5. – С. 24-30.
8. Овдиенко, Н.П. Экспериментальный туберкулёз коз / Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов, О.В. Якушева, В.И. Строганов, Е.П. Осипова, М.С. Калмыкова, Н.Г. Толстенко // Матер. междунар. научн.-практ. конф.- Киев, 2006.- С.64.
9. Овдиенко, Н.П. Туберкулёз коз / Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов, Е.П. Осипова, М.С. Калмыкова и др. // Международная научн.-практ. конф. «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных.- Москва, 2006.- С.312-317.
