ПЦР в целях контроля качества дезинфекции
Али Найманов
А. Х. Найманов
доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий
лабораторией микобактериозов ФГБНУ ВИЭВ
Москва, Российская Федерация
В.М. Калмыков
кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник
лаборатории микобактериозов ФГБНУ ВИЭВ
Москва, Российская Федерация
М.С. Калмыкова
кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры радиобиологии и вирусологии имени академиков А.Д. Белова и В.Н. Сюрина,
ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К. И. Скрябина
Москва, Российская Федерация
Е.П. Вангели
кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
лаборатории микобактериозов ФГБНУ ВИЭВ
Москва, Российская Федерация
Н.Г. Толстенко
кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник
лаборатории микобактериозов ФГБНУ ВИЭВ
Москва, Российская Федерация.
Аннотация
В статье проанализированы данные научной литературы, а также результаты проведённых авторами собственных исследований, связанных с диагностикой туберкулёза животных: диагностическое значение ПЦР в общем комплексе оздоровительных мероприятий, роль и значение объектов внешней среды, как источник заражения возбудителем туберкулеза, дезинфекция, средства дезинфекции и контроль качества дезинфекции. Авторами предлагается использовать ПЦР-метод для выявления ДНК M. bovis в целях контроля качества заключительной дезинфекции.
Ключевые слова: туберкулёз, дезинфекция, качество дезинфекции объекты внешней среды, ПЦР, ПЦР-исследование, санитарно-показательные микроорганизмы, микобактерии, устойчивость микобактерий, обеззараживание, заключительная дезинфекция.
Туберкулёз наносит значительный экономический ущерб животноводству и представляет серьёзную опасность в заражении людей. Поэтому организация и проведение обязательных противотуберкулёзных мероприятий была и остаётся актуальной проблемой.
Туберкулёз занимает особое место среди других хронических инфекционных болезней, он своеобразен тем, что долгие годы может протекать в скрытой форме, без проявления признаков болезни и не влияя на продуктивность и жизнедеятельность животных.
Инфекция легко и быстро распространяется среди поголовья животных, но искореняется с большим трудом. Резервуар инфекции так разнообразен и обширен, что мероприятия по борьбе с этой инфекцией должны охватить всех домашних и диких животных, а также и многочисленные объекты внешней среды.
Туберкулёз и в настоящее время остаётся одной из распространённых инфекционных заболеваний, при котором не разработаны высокоэффективные средства иммунной защиты и лечения. Поэтому основой профилактических и оздоровительных мероприятий при туберкулёзе животных была и остаётся диагностика болезни, а основным методом прижизненной диагностики является аллергический метод с применением внутрикожной пробы с ППД туберкулином для млекопитающих.
Тем не менее, следует отметить, что и при диагностике туберкулёза нет ни одного идеального метода. Применение внутрикожной туберкулиновой пробы создаёт две главные и противоположные проблемы: 1-я проблема – это перевыявление реагирующих животных с «неспецифическими» реакциями на туберкулин; 2-я проблема – недовыявление больных туберкулёзом животных.
По этой причине прижизненная диагностика туберкулёза крупного рогатого скота одной внутрикожной туберкулиновой пробой не может быть единственным и идеальным диагностическим средством. Диагностика должна быть комплексной с применением внутрикожной туберкулиновой пробы и других дополнительных методов диагностики (М.И. Гулюкин и соавт., 2012, 2014; А.Х. Найманов и соавт., 2015, 2018).
Достижения в области молекулярной биологии привели к разработке новых подходов к обнаружению возбудителя в исследуемом материале. На протяжении последних лет при диагностике некоторых инфекционных болезней широко используются молекулярные технологии, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Анализ литературных данных и проведённых собственных исследований показывает, что при применении ПЦР при диагностике туберкулёза крупного рогатого скота разными исследователями были получены неоднозначные результаты. Поэтому до настоящего времени единого мнения о диагностической значимости ПЦР не имеется, и этот метод не нашёл широкого применения в ветеринарной практике нашей страны и за рубежом более чем за 30-летний период изучения (Е.П. Осипова, 2004; М.С. Калмыкова, 2006, 2007; А.Х. Найманов и соавт., 2009, 2014, 2016, 2018).
В соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулёза животных» от 2002 г. ПЦР применяют при постановке диагноза на туберкулёз у крупного рогатого скота: при отсутствии видимых изменений или возникших затруднениях при определении характера патологоанатомических изменений; для определения видовой принадлежности выделенных микобактерий. Положительный результат ПЦР свидетельствует о наличии в организме исследованного животного ДНК определённого вида возбудителя туберкулёза. Отрицательный результат указывает на отсутствие ДНК возбудителя туберкулёза в исследуемых образцах биоматериала от животных или выделенной культуры.
Известно, что заражённые туберкулёзом животные выделяют возбудителя болезни и загрязняют объекты окружающей внешней среды своими выделениями. На стенах помещений, где содержатся больные животные, на станках поилок, в воде оседает и накапливается значительное количество микобактерий, выделенных из организма заражённых туберкулёзом животных. Заражённые объекты внешней среды могут стать резервуаром возбудителя туберкулёза и источником заражения здоровых животных.
История открытия и изучения микобактерий восходит к 1882 году, когда Р.Кох впервые обнаружил возбудителя туберкулеза и в эксперименте по заражению лабораторных животных доказал, что именно эти микроорганизмы вызывают заболевание туберкулезом. В дальнейшем были открыты и многие другие виды патогенных и непатогенных микобактерий. Со времен Р.Коха существовало предположение, что микобактерии туберкулеза имеют воскоподобную оболочку, которая обусловливает их кислотоустойчивость. В последствие было установлено, что в химический состав микобактерий входят жиры, белки, углеводы и минеральные соли. Значительную часть составляют липиды, у различных видов микобактерий туберкулеза липиды составляют от 10 до 40% их массы.
Микобактерии объединены общим признаком – способностью стойко сохранять воспринятую окраску, даже после воздействия разных кислот, щелочей и спирта. Поэтому они являются кислото-, щёлоче- и спиртоустойчивыми. Кислотоустойчивость связана с липидными фракциями микобактерий (Р.О.Драбкина,1963; А.П.Аликаева, 1963; О.В.Мартма, 1990; C.Ratledce, V.Stanford, 1983).
Микобактерии содержат растворимые в хлороформе миколовые кислоты с длинными разветвленными цепями от 60 до 90 атомов углерода. Содержание Г+Ц (гуанин + цитазин) в ДНК колеблется от 62 до 70% (Т.Ф.Оттен, А.В.Васильев, 2005).
Микобактерии обладают уникальными биологическими свойствами – способностью к длительному сосуществованию с макроорганизмом, адаптивностью к размножению в организме различных видов животных и человека, высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям внешней среды.
По мнению многих исследователей микобактерии туберкулёза окружены оболочкой, состоящей из особого жирового вещества, похожего по своим свойствам на воск. Считается, что восковая оболочка микобактерий придает устойчивость к неблагоприятным воздействиям окружающей внешней среды и предохраняет от переваривания в соках и клетках живого организма (А.Х. Найманов и соавт., 2014, 2018).
В связи с высокой устойчивостью микобактерий туберкулёза, некоторые авторы предлагали различные препараты для обеззараживания объектов внешней среды.
З.А. Вранчан (1957) указывал, что при обсеменении возбудителем туберкулёза обеззараживание деревянных и кирпичных поверхностей достигается при применении: а) осветвлённого раствора хлорной извести с экспозицией 6 часов; б) 10%-го раствора серно-крезоловой смеси, подогретой до 60-700С, при суточной экспозиции; в) 20% взвеси свежегашённой извести, после трёхкратного нанесения с часовым интервалом и последующей экспозицией в течение суток.
Наиболее быстрое и надёжное обеззараживание достигается при использовании щелочного раствора формальдегида, содержащего 3% формальдегид и 3% едкий натр при экспозиции 3 часа.
М.Г. Нигматуллин (1980) рекомендует использовать технический раствор фенолятов натрия (ТДФН) с полигликолевой смолой (ПГС) или каустическую соду с ПГС для дезинфекции объектов внешней среды
В соответствии действующих Санитарных и Ветеринарных правил от 1996 года при проведении оздоровительных мероприятий в неблагополучных по туберкулёзу животноводческих хозяйствах, после освобождения помещений от больных животных и механической очистки этих помещений проводят дезинфекцию 3%-ным раствором формальдегида и каустической соды. После завершения ветеринарно-санитарных мероприятий, проведения заключительной дезинфекции всех помещений на территории фермы и лабораторной проверки качества дезинфекции с неблагополучной фермы снимают ограничения.
В настоящее время лабораторный контроль качества текущей и заключительной дезинфекции при туберкулёзе животных проводят в соответствии с «Методическими указаниями по контролю качества дезинфекции объектов, подлежащих ветеринарному надзору» (№ 432-3, утверждённых Главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР от 16 мая 1988 г.). Для контроля качества дезинфекции применяют бактериологический метод. При бактериологическом контроле качества дезинфекции определяют наличие на поверхностях обеззараживаемых объектов жизнеспособных клеток санитарно–показательных микроорганизмов. При туберкулезе качество текущей и заключительной дезинфекции контролируют по наличию или отсутствию стафилококков (aureus, epidermatis, saprrophiticus) или микобактерий в исследуемых образцах.
Проведение контроля качества дезинфекции методом бактериологического контроля довольно длительный, трудоёмкий и недостаточно объективный.
Т.В. Вицинец (2002) установила, что посторонняя микрофлора, выделяемая при использовании бактериологических методов контроля качества дезинфекции, оказывает антагонистическое воздействие на санитарно–показательные микроорганизмы (стафилококки и микобактерии), что может привести к искажению оценки ее эффективности. Для подавления сопутствующей микрофлоры при бактериологическом контроле автором предложено дополнительно использовать обработку исследуемого материала различными химическими веществами, что усложняет и без того сложную и трудоёмкую процедуру бактериологического исследования.
В доступной отечественной и зарубежной литературе мы не обнаружили данных о возможности исследования объектов внешней среды и определения качества дезинфекции методом ПЦР при туберкулёзе животных.
В связи с вышеуказанным, целью работы было установление возможности использования ПЦР для обнаружения возбудителей туберкулёза в объектах внешней среды и определения качества дезинфекции при туберкулёзе животных.
Материалы и методы исследования:
Исследования проводили в лаборатории микобактериозов и в В.Волоцком филиале ВИЭВ о. Лисий. На опытной базе ВИЭВ исследовали 17 коз, заражённых M. bovis, M. tuberculosis и M. avium. От заражённых туберкулёзом коз исследовали 147 проб носовой слизи, 147 проб крови, 146 проб фекалий и 504 пробы патматериала. Кроме того, исследовали 30 морских свинок, 30 кроликов и 24 кур (90 проб от морских свинок и кроликов, 72 пробы от кур).
Исследовали 135 проб смывов со стен боксов, где содержались заражённые M.bovis, M.tuberculosis и M.avium животные, 135 проб смывов со стенок поилок и 135 проб воды из поилок.
Объекты внешней среды исследовали методом ПЦР каждые 30 дней на протяжении восьми месяцев после заражения животных, после убоя животных, проведения механической очистки и дезинфекции боксов.
Для ПЦР-исследования использовали тест-системы производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора: «АВИУМ». «МТБ-КОМ» и «МТБ-ДИФ». Выделение ДНК, постановку ПЦР и учёт результатов проводили в соответствии с наставлениями по применению тест-систем. Постановку ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» проводили на приборе RotorGene-6000 производства «CorbettResearch» (Австралия). Полученные в ходе экспериментов данные анализировали с помощью программного обеспечения «RotorGene 6.0».
Результаты исследования:
В начале эксперимента и на протяжении восьми месяцев после заражения животных результаты ПЦР-исследования объектов внешней среды были отрицательные. В дальнейшем, через восемь месяцев после заражения коз, были получены положительные результаты при исследовании воды и смывов со стенок поилок из боксов с животными, заражёнными M.bovis и M.tuberculosis. В боксах, где содержались заражённые M.avium козы, не было получено ни одного положительного результата ПЦР.
Полученные результаты доказывают, что заражённые M.bovis и M.tuberculosis козы выделяют возбудителей туберкулёза во внешнюю среду. На стенках поилок и в воде оседает и накапливается значительное количество микобактерий, что позволило обнаружить ДНК возбудителей туберкулёза в воде и смывах из поилок.
Через девять месяцев после начала эксперимента животных убили. Все помещения механически очистили и провели заключительную дезинфекцию. Для контроля качества дезинфекции был использован метод ПЦР.
Пробы отбирали с различных участков поверхности боксов (пола, стен, перегородок, поилок) по пять смывов с каждой поверхности стерильными ватно-марлевыми тампонами, смоченными в стерильной дистиллированной воде. Участки площадью 10х10 см тщательно протирали до полного снятия с поверхности всех имеющихся на ней загрязнений, после чего тампоны помещали в пробирку. Плотные загрязнения (корочки) снимали с помощью стерильного скальпеля и помещали в пробирки.
В результате проведённых исследований на наличие ДНК возбудителей туберкулёза положительных результатов ПЦР не получено ни в одном случае. Поскольку качество дезинфекции признают удовлетворительным при отсутствии роста тест–культуры во всех пробах, то мы считаем, что отсутствие ДНК возбудителей туберкулёза во всех исследованных пробах позволяет признать качество дезинфекции удовлетворительным.
На основании проведённых исследований и полученных результатов можно сделать выводы.
Выводы:
1. Экспериментально заражённые разными видами (M. bovis и M. tuberculosis) козы выделяют искомый вид возбудителя во внешнюю среду, что подтверждается положительным результатом ПЦР-исследования объектов внешней среды из боксов с заражёнными козами и патматериала от лабораторных животных, содержавшихся в клетках внутри боксов с заражёнными животными.
2. Результаты исследований ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» свидетельствуют о более высокой чувствительности и специфичности этого формата детекции.
3. Исследование объектов внешней среды методом ПЦР на наличие ДНК возбудителей туберкулёза позволяет определить качество проведённой дезинфекции.
Заключение:
Для лабораторного контроля качества текущей и заключительной дезинфекции помещения, где содержались больные туберкулёзом животные, следует пользоваться ПЦР-методом исследования объектов внешней среды.
Полученные результаты исследований следует использовать при проведении оздоровительных мероприятий в неблагополучных по туберкулёзу хозяйствах в целях контроля качества проведённой текущей и заключительной дезинфекции помещений ферм и прифермерских территорий.
Указанный способ контроля качества дезинфекции можно использовать и при других инфекционных заболеваниях животных.
Литература
1. Вицинец Т.В. Сравнительная оценка методов бактериологического контроля качества дезинфекции при туберкулёзе животных: Автореф. дисс……канд.вет.наук 16.00.03 / Т.В. Вицинец; Омск, 2002.
2. Вранчан З.Э. Дезинфекция животноводческих помещений при туберкулёзе: Автореф. дисс. канд. вет. наук. – Москва, ВИЭВ, 1957. – 15 с.
3. Гулюкин М.И., Найманов А.Х., Овдиенко Н.П., Ведерников В.А. и др. Методические наставления по проведению исследований при микобактериозах животных. – Москва, 2012. – 85 с.
4. Гулюкин М.И., Найманов А.Х., Альбертян М.П., Симонян Г.А. и др. Практическое пособие по мониторнигу бруцеллёза, туберкулёза, паратуберкулёза и лейкоза крупного рогатого скота. – Москва, 2014. – 75 с.
5. Дудницкий И.А., Бричко В.Ф., Барабанов И.И., Беляев И.Я., Меньш А.Ф. и др. Дезинфекция объектов животноводства при бруцеллёзе и туберкулёзе. – Целиноград, 1989. – 22 с.
6. Калмыкова М.С. Диагностическая ценность ПЦР-тест-систем при туберкулёзе животных: Автореф. дисс….. канд. вет. наук: 16.00.03 / М.С. Калмыкова; ВИЭВ. — Москва, 2007. — 27 с.
7. Калмыкова М.С. Применение метода ПЦР при диагностике туберкулёза коз / М.С. Калмыкова, Е.П. Осипова, Н.Г. Толстенко, В.И. Строганов // Ветеринарная патология.- 2006.- №3.- С.149-151.
8. Методические указания по контролю качества дезинфекции объектов, подлежащих ветеринарному надзору. Утв. Главным управлением ветеринарии с Государственной ветеринарной инспекцией. № 432-3 от 16 мая 1988 г.
9. Найманов А.Х., Калмыкова М.С., Осипова Е.П. ПЦР на современном этапе борьбы с туберкулёзом крупного рогатого скота // Современные проблемы диагностики и профилактики зооантропоинфекций. – Омск, 2009. – С. 133-140.
10. Найманов А.Х., Гулюкин М.И. Микобактериальные инфекции крупного рогатого скота (туберкулёз, паратуберкулёз). – Москва, Зооветкнига, 2014. – 235 с.
11. Найманов А.Х., Вангели Е.П., Толстенко Н.Г., Калмыкова М.С. ПЦР на современном этапе борьбы с туберкулёзом крупного рогатого скота. – Ветеринария, 2016. — №2. – С. 20-23.
12. Найманов А.Х., Сотников А.Н., Толстенко Н.Г., Вангели Е.П. Влияние спиртовой настойки восковой моли на рост микобактерий. – Ветеринария и Кормление, 2018. — № 1. – С. 16-17.
13. Найманов А.Х., Калмыков В.М. Туберкулёз животных. – Издательство «Лань», 2018. – 500 с.
14. Нигматуллин М.Г. Изыскание новых дезинфектантов и их применение в системе противотуберкулёзных и противобруцеллёзных мероприятий: Автореф. дисс. канд. вет. наук 16.00.03. – Казань, 1980. – 18 с.
15. Осипова Е.П. Применение ПЦР для идентификации микобактерий и её диагностическая значимость при туберкулёзе крупного рогатого скота: Автореф. дисс. канд. биол. наук. – Москва, ВИЭВ, 2004. – 21 с.
16. Притулин П.И., Привалова Н.В., Калмыкова Т.П., Опарина А.П. Методические рекомендации по обнаружению патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды. _ Москва, 1984. – 39 с.
17. Санитарные и Ветеринарные правила. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных. – Москва, 1996. – 251 с.
